다발성 골수종에서 유전 적 위험 계층화에 FISH라고 불리는 Situ Hybridization의 형광 적용은 필수적입니다. FISH 보고서의 중요한 부분은 모든 유핵세포가 아니라 항-CD138 마그네틱 비드로 분류하거나 세포질 카파 또는 람다 경쇄 면역글로불린으로 마킹하여 cIg FISH라고 불리는 FISH 테스트를 통해 특이적으로 정제되거나 확인된 클론 혈장 세포입니다. 혈장 세포 분류 후 상간 FISH 또는 cIg FISH는 골수에서 혈장 세포의 상대적으로 낮은 비율로 인해 다발성 골수종의 진단에 중요한 것으로 밝혀졌습니다.
그러나 이러한 방법에는 복잡한 공정, 높은 시편 요구 및 높은 실험 비용을 포함한 몇 가지 단점이 있습니다. 혈장 세포는 골수 얼룩에 신속하게 위치 할 수 있습니다. 이를 바탕으로 우리는 다발성 골수종 세포의 검출을 위해 골수 도말 FISH를 사용합니다.
이 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었으며 우한 대학의 중난 병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 표본은 중국 우한 대학의 중난 병원 혈액학과의 다발성 골수종 환자로부터 수집되었다. 첫 번째 0.2 밀리리터의 골수 용액을 깨끗한 일회용 유리 슬라이드에 놓고 골수를 신속하게 제거하여 골수 얼룩을 균일 한 두께와 날카로운 꼬리로 퍼뜨린 다음 자연스럽게 말립니다.
골수 필름을 실온에서 약 10 초 동안 Wright-Giemsa 용액 1 밀리리터로 덮으십시오. 한 밀리리터의 인산염 완충액을 슬라이드에 첨가하면, 염료 용액이 건조되거나 슬라이드에서 흘러내리는 것을 방지하기 위해 주의가 요구되었다. 염료 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 15 분 동안 유지하십시오.
슬라이드를 깨끗한 물로 헹구고 실온에서 공기 중에서 건조시킵니다. 순방향 광 현미경을 사용하여 악성 혈장 세포를 감지하면 혈장 세포가 잘 분산되어야합니다. 이제 우리가 현장에서 보는 것은 상당히 분산 된 혈장 세포입니다.
이것은 전형적인 이중 핵 혈장 세포입니다. 혼성화 된 영역을 10 분 동안 고정 용액으로 덮어 혈장 세포를 변색시키고 고정시킵니다. 슬라이드를 탈이온수로 헹구고 실온에서 공기 중에서 건조시킵니다.
두 번 SSC 버퍼가 들어있는 항아리를 수조에서 섭씨 56도까지 예열하십시오. 제조된 골수 도말기를 예열된 SSC 완충액에서 두 번 10분 동안 세척한 다음, 실온에서 탈이온수에 침지시킨다. 에탄올 구배에 도말기를 각각 70%85%와 100%에탄올로 1분 동안 탈수시킨다.
얼룩을 공기 중에 10 분 동안 말립니다. 먼저 17번 염색체 프로브 혼합물의 센트로미어에 TP53을 하이브리디제이션 영역에 추가하고 커버 슬립 프레스로 미세한 뾰족한 핀셋으로 부드럽게 덮어 아래에서 기포를 제거합니다. 커버 슬립의 모든면을 고무 시멘트로 밀봉하여 우수한 견고성을 보장합니다.
고무 시멘트를 응고시킨 후 슬라이드를 자동 FISH 기계에 올려 놓고 5분 동안 섭씨 78도에서 변성을 수행한 후 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 혼성화를 수행하였다. FISH 기계에서 슬라이드를 가져옵니다. 미세한 뾰족한 핀셋을 사용하여 고무 시멘트를 부드럽게 제거하십시오.
슬라이드를 실온에서 SSC에 두 번 담그고 약 한 분 또는 두 분 동안 커버 슬립을 세척합니다. 슬라이드를 섭씨 68도 예열 완충액으로 수조에서 두 분 동안 세척하십시오. 슬라이드를 섭씨 37도 수조에서 두 번 SSC로 한 분 동안 씻으십시오.
어둠 속에서 바로 설치하여 혼성화 된 부위에 10 마이크로 리터의 DAPI에서 10 분 동안 완전히 건조시키고 커버 슬립으로 덮으십시오. 형광 현미경 상에 적합한 필터 세트를 사용하여 혼성화 슬라이드를 보고, 단색 청색 형광단 광학 필터를 사용하여 세포 핵의 형광 강도를 관찰한다. DAPI 필터 세트에서 세포 핵 이미지를 촬영합니다.
CEP17은 녹색 형광으로 표지되었다. 스펙트럼 녹색 형광단 광학 필터를 사용하여 CEP17의 위치를 관찰하십시오. CEP17 신호 이미지를 녹색 필터 세트에서 가져옵니다.
TP53 유전자를 주황색 형광으로 표지하였다. 스펙트럼 오렌지 형광단 광학 필터를 사용하여 TP53을 관찰하고, TP53 신호 이미지를 세트 아래에서 촬영하고,이 세 이미지를 전체로 병합하고 수치 이상을 검사하십시오. 정상 간상 세포에서 두 개의 주황색 및 두 개의 녹색 신호가 핵 내부에서 관찰되고 청색 형광은 한 쌍의 정상 염색체 17을 나타낸다.
결과는 다발성 골수종 환자에서 골수의 형태학 및 유전학을 보여주었다. 그림 A는 골수 도말에서 혈장 세포의 15 %가 정상보다 많은 양의 세포질과 함께 더 크고 어둡고 핵을 갖는 것으로 나타났습니다. 도 B는 골수 번짐에서 유핵혈장 세포를 대표하여 대표적인 그레이스케일 이미지를 나타내었다.
그림 C는 혈장 세포의 한 상간 핵에서 네 개의 주황색과 네 개의 녹색 신호를 보여 주었으며, 이는 염색체 17의 네 사본이 핵에 국한되어 있음을 시사한다. 도 D는 이 환자의 비정상적인 염색체 핵조영이 하나의 핵에서 두 쌍의 염색체 17을 확인한 것을 보여주었다. 골수 얼룩은 항응고제 골수 표본보다 훨씬 쉽게 얻을 수 있는데, 항응고 골수를 얻기 위해서는 핵을 얻기 위한 복잡한 절차가 필요하기 때문입니다.
따라서, 우리는 다발성 골수종 세포의 검출을 위해 골수 도말 FISH에 대한 설득력있는 방법을 확립했습니다.
