NIH 보조금 RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622,​​ Hartwell 재단, 그리고 도리스 듀크 자선 재단 지원. 박사 Paczesny은 에릭 Hartwell 기금과 에이미 Strelzer Manasevit 연구 프로그램의 수사관이다.

1. 실험 일 0 : IL-2Rα, REG3α과 HGF에 대한 캡처 항체와 샘플 준비 및 엘리사 테스트 플레이트 코팅 <ol><li> 분석 할 플라즈마 나누어지는 샘플은 해동과 플라즈마의 상단에있는 아래쪽과 지질의 혈전을 분리하는 10 분에 12,000 rpm으로 불렀고, 당겨 될 것입니다. undiluted 플라즈마의 150 μl는 미리 정의 된지도에 따라 수동으로 pipetting하여 (소스 판) 96 - 웰 V-바닥 판에 각 샘플에서 도금 될 것입니다. aliquots는 parafilm으로 포장 전체 과정에서 4 ° C에서 습한 챔버에 보관되며 더 이상보다 72 시간. </li><li> IL-2Rα 및 HGF 캡처 항체는 재구성 및 제조업체 사양 및 50 μl 당 희석 한 후 밀봉과 4에서 하룻밤 incubated 아르 각각 96도 높은 구속력을 반 잘 플레이트의 각 잘 ° C.에 도금 할 수 또한, 많은 플레이트는 37 ° C에서 건조 ° C 나중에 사용하기 위해, 의존 4에 저장할 수 있습니다단백질의 안정성에 들죠. </li><li> REG3α 캡처 항체 그런 다음 밀봉과 4에서 하룻밤 incubated하는 384 잘 Nunc 맥시 - Sorp 판의 각 잘 ° C.에 도금 될 것 제조업체 코팅 버퍼 25 μl를 사용하여 제조업체 프로토콜에 따라 희석 될 것입니다 </li></ol> 2. 실험 1 일 : IL-2Rα 엘리사 (그림 1) <ol><li> IL-2Rα 테스트 판은 세척 TBS에서 곤드레 만드레 취한로 차단하고, 표준 재구성되어 8 포인트 표준 곡선은 제조업체 프로토콜에 따라 준비가되어 있습니다. </li><li> 차단 단계에 따라 판을 세척 한 후, undiluted 플라즈마의 50 μl는 소스 판에서 엘리사 테스트 판에 중복으로 도금되어 있으며 각 표준의 50 μl가 중복으로 도금되어 있습니다. 판 300 rpm으로 설정 판 회선 근에 밀봉하고 상온에서 2 시간에 incubated 수 있습니다. </li><li> 플라즈마는 IL-2Rα 엘리사 시험 접시에서 복원 및 해제에 다시 배치됩니다플라즈마 소스 판을 희석. 엘리사는 제조업체 프로토콜 (반 잘 접시에 따라 조정 볼륨) 및 450-570 nm의에 판 리더 집합을 사용하여 읽을 수 각도의 광학 밀도에 따라 완료하고, 데이터를 저장하고 분석합니다. </li></ol> 3. 실험 1 일 : REG3α 엘리사 (그림 1) <ol><li> undiluted 플라즈마의 10 μl는 별도의 V-아래 소스 판로 전송됩니다. 제조업체에서 제공 희석 버퍼의 90 μl은 1시 10분 희석 소스 판을 만드는 각 잘에 추가됩니다. </li><li> REG3α 엘리사는 제조업체 프로토콜에 따라 수행됩니다 (볼륨 384 잘 접시에 따라 조정)과 각도의 광학 밀도는 450-620 nm의로 설정 접시 리더를 사용하여 읽을 수되며, 데이터 저장 및 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 실험 1 일 : Elafin 및 캡처 항체와 TNFR1 테스트 플레이트 코팅 <ol><li> Elafin 및 TNFR1 캡처 항체는 재구성 및 dil 될 것입니다제조업체 사양 및 50 μl 당 uted 후 봉인하고 Elafin 동안 실온에서 하룻밤 incubated 아르 각각 96도 높은 구속력을 반 잘 플레이트의 각 잘에 도금 및 ° C 4에 TNFR1에 대한 것입니다. </li></ol> 5. 실험 일 1-2 : HGF 엘리사 (그림 1) <ol><li> IL-2Rα 엘리사를 완료하고 시험을 보장 한 후 반복 할 필요가 없습니다, undiluted 플라즈마의 60 μl는 새로운 소스 판에 전송하고 다음 1 개 PBS에 1 % BSA의 60 μl은을 각 잘에 추가됩니다 1시 2분 희석 플라즈마 소스 판. </li><li> HGF 테스트 판은 세척 TBS에서 곤드레 만드레 취한로 차단하고, 표준 재구성되어 8 포인트 표준 곡선은 제조업체 프로토콜에 따라 준비가되어 있습니다. </li><li> 차단 단계에 따라 판을 세척 한 후, 1시 2분 희석 플라즈마의 50 μl은 엘리사 테스트 판에 중복으로 도금되어 있으며 각 표준의 50 μl가 중복으로 도금되어 있습니다. 플레이트는 봉인되고300 RPM으로 설정 판 회선 근에 실온에서 하룻밤 incubated. </li><li> 1시 2분 희석 플라즈마는 HGF 엘리사 테스트 판에서 복원하고 1시 2분 희석 플라즈마 소스 판에 다시 배치됩니다. 엘리사는 제조업체 프로토콜 (반 잘 접시에 따라 조정 볼륨) 및 450-570 nm의에 판 리더 집합을 사용하여 읽을 수 각도의 광학 밀도에 따라 완료하고, 데이터를 저장하고 분석합니다. </li></ol> 6. 실험 2 일 : Elafin 엘리사 <ol><li> undiluted 플라즈마의 10 μl는 새로운 소스 판으로 전송됩니다 후 1 개 PBS에 1 % BSA의 190 μl는 플라즈마 dluted 1시 20분 200 μl를 각 잘에 추가됩니다. </li><li> Elafin 엘리사는 450-570 nm의로 설정 접시 리더를 사용하여 읽을 수 제조업체 프로토콜 (볼륨이있는 반 잘 접시에 따라 조정), 그리고 각도의 광학 밀도에 따라 수행하고, 데이터를 저장하고 분석했다. </li></ol> 7. 실험 다Y 2 : TNFR1 엘리사 <ol><li> PBS에 1 % BSA의 25 μl가 1시 25분 희석 플라즈마의 125 μl를 얻을 수 1시 20분 소스 판 (현재 1시 20분 플라즈마의 100 μl를 포함)에 추가됩니다. </li><li> TNFR1 엘리사는 제조업체 프로토콜에 따라 완료 (반 잘 접시에 따라 조정 볼륨 포함)과 각도의 광학 밀도는 450-570 nm의로 설정 접시 리더를 사용하여 읽을 수 있으며, 데이터 저장 및 분석. </li></ol> 8. 실험 2 일 : IL-8 엘리사 <ol><li> 1시 2분 희석 플라즈마의 60 μl는 새로운 소스 판에 전송하고 다음 IL-8 희석제 180 μl은 1시 6분 희석 플라즈마 소스 판을 각 잘에 추가됩니다. </li><li> IL-8은 엘리사는 제조업체 프로토콜에 따라 완료 (반 잘 접시에 따라 조정 볼륨 포함)과 각도의 광학 밀도가 450-570 nm의로 설정 접시 리더를 사용하여 읽을 수되며, 데이터 저장 및 분석. </li></ol> 모든 ELISAs은 unuse에게 완료되면D 주식 플라즈마 해동 aliquots로 대체하고 나중에 사용하기 위해 냉동 될 것입니다.

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	<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease.">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin.">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).</li><li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease.">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease.">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li><li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation.">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li><li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease.">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li><li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease.">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li><li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes.">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li><li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines:+the+sequential+ELISA.">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li><li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification.">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

<html> 여기에 제시된 순서 엘리사 방법은 마우스 9,10에서 얻은 희귀 한 질병 또는 플라즈마 샘플과 인간의 과목에서 샘플로 바꾸어 놓을 수없는 취득 및 / 또는하기 어려울 수도 플라즈마의 작은 볼륨에 여러 혈장 단백질의 측정 할 수 있습니다. 연속 ELISAs는 일반적으로 필요로하는 ELISAs으로 증가 플라즈마 희석 계수의 순서로 수행 플라즈마 희석 ≥ 일반적으로 원하는 경우이 작업을 수행 할 수 있지만, 복원 할 필요가 없습니다 1시 10분 않고 있습니다. 연속 엘리사을 수행 할 수있는 능력은 플라즈마 다른 시약과 혼합되어 있거나하는 다른 희석 버퍼가 플라즈마에 필요한되는 엘리사 키트 / 프로토콜에 의해 제한되며이 다시 사용할 수있는 샘플로 인해 해당 호환되지 않는 문제에 ablility을 precludes 버퍼 / 시약은 특정 테스트의 성능에 영향을 것입니다. 신중한 계획을 통해 10 명 이상 ELISAs은 같은 플라즈마 샘플에서 수행 할 수 있습니다. 다닐 &quot;&gt; 개인 실험실 시험 과목에서 샘플에 대한 관심의 단백질의 예상 플라즈마 농도에 따라 interpretable 결과를하기 위해 플라즈마 dilutions을 조정해야 할 수도 있습니다. 실험실 장비의 차이는 부화와 colorimetric 개발을 최적화 할 필요가 될 수 있습니다 시간, 세차의 수 및 / 또는 세탁은 특정 엘리사을 최적화하기 위해 시간을 즐겨보십시오. 높은 처리량 용량과 정확성을 향상하고 비용 효율적인 방식으로 분석을 수행하기 위해 384 잘 접시에 분석 및 스태킹 장치와 자동 플레이트 와셔 할 수있는 로봇 액체 처리 플랫폼의 사용을 권장합니다. 이 장비는 여러 사용자에 의해 수행 분석의 정확성과 정밀도를 향상, 간 및 간 분석 편차를 줄이기 위해 분석의 일관성을 제공하는 데 도움이됩니다. 1)의 대부분을 : 우리는 두 가지 이유에 사용할 멀티 플랫폼을 통해 순차적 엘리사를 사용소설 단백질에 대한 항체 쌍 쉽게 구슬 또는 기타 자료에 복합뿐만 아니라 시간이 많이 걸릴 비싼 수 없습니다, 2) 각 엘리사의 assays 간 반응성 11 부재에 보조 멀티 플렉스 microarray 또는 구슬,보다 더 정확한 있습니다. 신뢰할 수있는 방법은 멀티 플렉스, 구슬 기반 microarrays를 수행하기 위해 설립되어있는 경우,이 순서 엘리사 과정을 대체 할 수 수 있지만, 구슬 및 /에 항체를 결합한 할 수있는 능력이나 할 원하는 단백질의 수에 의해 제한 될 수 있습니다 분석했다.

급성 이식 - 대 - 호스트 질환 (GVHD), allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 후 비 재발 사망률 (NRM)의 주요 원인은 3 장기 시스템의 장애에 의해 측정된다 : 피부, 간, 위장 (GI) 기관 4. 급성 GVHD는 일반적으로 두 사람 사이와 팔주 이식 후 발생하지만 나중에 발생할 수 있으며, 종종 조절 처방 독성, 감염이나 약물의 부작용 등의 사후 HSCT 합병증의 임상 구분할 수 있습니다. 연속 엘리사를 사용하여 proteomic 전략과 높은 처리량 검증의 사용을 통해, 우리는 누구의 농도 GVHD의 임상 발현의 발병에 수치가 올라 6 단백질을 확인했습니다. 4 biomarker 패널로 결합 IL-2Rα, TNFR1, HGF와 IL-8은 임상 증상의 발병에 GVHD 진단 할 수 있으며 독립적으로 GVHD 심각도 1 포스트 HSCT 생존을 예측할 수 있습니다. Elafin, SK의 GVHD를위한 biomarker에서, 약물 폭발과 같은 다른 원인에서 GVHD 발진과 발진을 구별 할 수 있으며 이식 생존 2 예측할 수 있습니다. 우리는 최근에 낮은 위장관의 GVHD의 biomarker로 REG3α 확인했습니다, 표적 장기는 대부분의 NRM과 관련된. 플라즈마 REG3α 농도가 안정적 후 HSCT 설사의 원인으로 GVHD 파악하고 진단 장 biopsies에 GVHD의 histologic 정도 상관 관계를 할 수 있습니다. GI GVHD의 발병에 REG3α 농도는 GVHD 치료와 NRM 3 응답을 예측 할 수 있습니다. 임상 치료에 이러한 검증 GVHD 생체의 결합은 현재 임상 시험에서 조사되고있다. 이 실험은 바꾸어 놓을 수없는 제한된 수량의 아르 GVHD 발병시 2000 년과 2010 사이에 HSCT를받은 환자에서 수집 한 작은 플라즈마 aliquots에서 수행되었다. 이 샘플의 고귀한 특성으로 인해, 우리는 만난을 개발했습니다초과 동결 - 해동 사이클, 해동 시간과 플라즈마의 사용을 제거 할 수있는 효율적 재현 방식으로 여러 혈장 단백질의 농도를 측정 석탄 통. 이 기술은 (들)은 다른 시약과 혼합 할 필요가 없습니다 샘플을 제공 같은 샘플에서 여러 단백질 / 관심 크린 시토 킨에 대한 ELISAs을 수행하기 위해 적용 할 수 있습니다. 엘리사 키트는 사전 코팅 플레이트, 96도 반 잘 플레이트 또는 384 잘 접시와 함께 제공되지 않을 경우 자세한 샘플 / 시약의 사용을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 원고는 GVHD 생체 측정의 기술적 측면에 초점을 맞추고 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 인간 IL-2 R 알파 Duoset </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 HGF Duoset </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 IL-8 OptEIA KIT II </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> AB-검색 조립 인간 PAP1 (REG3α) 키트 </td><td> MBL 국제 </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> AB-경기 유니버설 키트 </td><td> MBL 국제 </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 sTNFRI/TNFRSF1A Duoset </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 Trappin-2/Elafin Duoset </td><td> R &amp; D 싸이유래 </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 폴리스티렌 원추형 바닥 판 </td><td> 열 과학 </td><td> 249570 </td><td> 플라즈마 소스 판에 사용 </td></tr><tr><td> Costar 절반도 높은 구속력을 96 - 웰 플레이트 </td><td> 코닝 </td><td> 3690 </td><td> IL-2Rα, HGF, TNFR1과 elafin ELISAs에 대한 </td></tr><tr><td> Nunc 384 잘 MaxiSorp 판 </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> REG3α 엘리사에 대한 </td></tr><tr><td> HyClone 인산은 1X 식염 버퍼 </td><td> 열 과학 </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민, 분수 V, 치료 열 충격 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> TBS의 차단기 곤드레 만드레 취한 </td><td> 열 과학 </td><td> 37,530 </td><td> IL-2Rα HGF와 TNFR1 ELISAs에 대한 차단 에이전트 </td></tr><tr><td> Dulbecco의식염 인산염 버퍼 </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> IL-2Rα, HGF, Elafin 및 TNFR1 ELISAs에 대한 버퍼를 씻어 </td></tr><tr><td> TMB 과산화수소의 Susbtrate </td><td> Kirkegaard 및 페리 연구소 </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반 20 </td><td> Acros의 유기물 </td><td> 233362500 </td><td> IL-2Rα, HGF, Elafin 및 TNFR1 ELISAs에 대한 버퍼를 씻어 </td></tr><tr><td> 황산 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 84,720 </td><td> (2N에 희석) 정류장 솔루션 </td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease

편견 발견 단백질 체학 전략은 임상 환경에서 진단 및 전조 테스트를 개선 할 수 있으며, 가이드 치료 개입에 도움이 될 수 있습니다 새로운 생체​​ 많은 수의을 식별 할 수있는 가능성이 있습니다. 후보 단백질의 큰 번호가 식별되면, 이러한 급성 발병시와 같은 유한 볼륨, 이벤트 중심과 바꾸어 놓을 수없는 아르 환자 플라즈마 샘플에서 신속하고 효율적인 방식으로 후보 생체를 확인하기 어려울 수 있습니다 그래프트 - 대 - 호스트 질환 (GVHD), allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)의 잠재적 생명을 위협하는 합병증. 최소화하기 위해 순차적 방식으로 IL-2Rα 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8 elafin 2, REG3α 3 (도 PAP1라고도 함) : 여기 여섯 확인 GVHD 단백질에 대한 상업적으로 이용 가능한 ELISAs을 수행하는 과정을 설명 동결 - 해동 사이클, 플라즈마 시간 및 플라즈마 사용을 해동. 최적의 연속 엘리사의 성능을 촉진하기 사소한 조정으로 제조업체 엘리사 키트 및 프로토콜을 사용하여 저희 연구실 년에 설립 된로 샘플 희석 요인에 의해 결정이 절차를 들면 우리는 순서대로 ELISAs을 수행합니다. 그 결과 플라즈마 biomarker 농도 그런 다음 컴파일하고 환자 일대에서 상당한 결과를 분석 할 수 있습니다. 이러한 생체는 연구 목적으로 현재 있지만, 임상 치료에의 설립은 현재 임상 시험에서 조사되고있다. 이 기술은 (들)은 다른 시약과 혼합 할 필요가 없습니다 샘플을 제공 같은 샘플에서 여러 단백질 / 관심 크린 시토 킨에 대한 ELISAs을 수행하기 위해 적용 할 수 있습니다. 엘리사 키트는 사전 코팅 플레이트, 96도 반 잘 플레이트 또는 384 잘 접시와 함께 제공되지 않을 경우 자세한 샘플 / 시약의 사용을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다.

<html> biomarker의 워크 플로우 및 타임 라인은 각각 표 1과 표 2에 자세히 설명되어 있습니다. 일단, 완료 6 개의 단백질의 농도는 이제 플라즈마의 150 μL의 총을 사용하여 동일한 플라즈마 샘플을 계량되었습니다. 시험 당 중복에 샘플을 도금은 CV의 10 % 이하가 최적이되면, 내부 품질 보증 할 수 있습니다. 여러 접시, 높은 수준의 일관성 광학 밀도에 순차적 엘리사를 수행하는 것은 선호 및 측정의 개선 간 판의 신뢰성을 허용하는 경우, 표준 곡선 약물 과용이라면서은 엘리사 성능 불일치 (그림 2)에 대한 평가보고 판 사이에 비교할 수 있습니다. tetramethylbenzidine colorimetric 기판과 높은 농도 약물 과용이라면서을 사용하여 개발 시간이 저희 연구실의 각 biomarker에 대한 관찰은 표 3에 나열되어 있습니다. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;ALT =&quot;그림 1 &quot;/&gt; 그림 1. IL-2Rα, REG3α 및 HGF ELISAs를위한 워크 플로우. 플라즈마 샘플은 IL-2Rα 엘리사 테스트 판에 도금 한 후 다른 ELISAs에 희석 소스 접시를 만들기 위해 복원합니다. HGF 엘리사를 들어, 플라즈마 IL-8의 1시 6분 희석 판을 준비하는 복원합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보시려면 여기를 클릭하세요</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 초기 REG3α GI GVHD의 biomarker 보고서 3 테스트 1084 환자에 해당하는 REG3α 농도를 측정하는 7 개의 엘리사 플레이트의 표준 곡선에 대한 광학 밀도. 플레이트들 사이 일관된 약물 과용이라면서은 플레이트들 사이 일관성있는 단백질 농도 측정을 보장합니다. 단백질의 농도플라즈마에서 샘플은 표준 곡선 광학 밀도에 샘플 광학 밀도를 비교하여 계산됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 실험의 날 0 </td><td> 1. 샘플을 준비 </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Rα, HGF와 REG3α 캡처 AB </td></tr><tr><td> 실험 1 일 </td><td> 1. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF 엘리사 (샘플 도금을 통해) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin와 TNFR 캡처 AB </td></tr><tr><td> 실험 2 일 </td><td> 1. HGF 엘리사 완료 </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin 엘리사 </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 엘리사 </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 엘리사 </td></tr><tr><td></td><td> 5. 사용하지 않은 얼혈장 </td></tr></tbody></table> 표 1. GVHD의 Biomarker 워크 플로우 개요 <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 일 0 </td><td colspan="3"> 샘플 준비 및 야간 캡처 몸 보육 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 엘리사 </td><td> IL-2Rα </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> 시간 (시간) </td><td> 0.0 </td><td> 블로킹 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td> 도금 샘플 </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;TD&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td> 감지 AB, 플라즈마 샘플을 복원 </td><td> 차단, 준비 &#39;샘플 (1시 10분 희석) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td> 도금 샘플 (1시 10분) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td> Streptavidin-HRP </td><td> 감지 AB </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td> TMB </td><td> Streptavidin-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td> 판 읽기 </td><td> TMB </td><td> 차단, 준비 &#39;샘플 (1시 2분 희석) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.5 </td><td></td><td> 판 읽기 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td> 도금 샘플 (1시 2분) </td><td> AB을 (하룻밤 배양) 캡쳐 </td><td> AB을 (하룻밤 배양) 캡쳐 </td><td></td></tr><tr><td> 2 일 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 시간 (시간) </td><td> 0.0 </td><td></td><td></td><td> 플라즈마, 감지 AB를 복원 </td><td> 차단, 준비 &#39;샘플 (1시 20분) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> 샘플 도금 (1시 2분) </td><td> 차단, 1시 20분 샘플 더 희석을 1시 25분 희석에 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> 샘플 도금 (1시 25분) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td></td><td></td><td> 판 읽기 </td><td> 감지 AB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 샘플 (1시 6분 희석)를 준비 </td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 감지 AB </td><td> 샘플 도금 (1시 6분) </td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> 판 읽기 </td&gt; <td> HRP </td><td> 감지 AB </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 판 읽기 </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 판 읽기 </td></tr><tr><td colspan="2"> 완료 후 </td><td colspan="6"> aliquots에 소스 플라즈마를 교체하고 나중에 사용하기 위해 냉동 </td></tr></tbody></table> 표 2. ELISAs을 수행하기위한 타임 라인. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 플라즈마 희석 계수 </td><td> 높은 표준 농도 </td><td> 기판 개발 시간 (분) </td><td> 높은 OD </td><td> 곡선 </td></tr><tr><td> IL-2Rα </td><td> 1시 1분 </td><td> 2000 PG / ML </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 선의 </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 1시 2분 </td><td> 4000 PG / ML </td><td> 22 </td><td> 2.1 </td><td> 4 매개 변수 </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 1시 6분 </td><td> 200 PG / ML </td><td> 12 </td><td> 2.7 </td><td> 4 매개 변수 </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 1시 10분 </td><td> 100 NG / ML </td><td> 12 </td><td> 1.7 </td><td> 4 매개 변수 </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 1시 20분 </td><td> 2000 PG / ML </td><td> 20 </td><td> 1.9 </td><td> 4 매개 변수 </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 1시 25분 </td><td> 800 PG / ML </td><td> 8 </td><td> 2.7 </td><td> 선의 </td></tr></tbody></table> 6 GVHD 생체에 대한 표 3. 엘리사 세부 정보.

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High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

여러 후보 생체의 높은 처리량 검증은 동결 / 해동 사이클을 최소화하고 귀중한 플라즈마 샘플을 사용하기 위해 순차적 엘리사에 의해 수행 할 수 있습니다. 여기, 우리는 순차적으로 여섯 가지 검증 플라즈마 생체에 대한 ELISAs을 수행하는 방법을 보여줍니다<sup&gt; 1-3</sup&gt; 이식 - 대 - 호스트 질환 (GVHD)의<sup&gt; 4</sup&gt; 동일한 플라즈마 샘플 있습니다.

급성 이식 - 대 - 호스트 질병의 생체의 유효성을 검사에 대한 높은 처리량 순차적 엘리사

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.7K 조회수.  University of Michigan. 여러 후보 생체의 높은 처리량 검증은 동결 / 해동 사이클을 최소화하고 귀중한 플라즈마 샘플을 사용하기 위해 순차적 엘리사에 의해 수행 할 수 있습니다. 여기, 우리는 순차적으로 여섯 가지 검증 플라즈마 생체에 대한 ELISAs을 수행하는 방법을 보여줍니다 1-3 이식 - 대 - 호스트 질환 (GVHD)의 4 동일한 플라즈마 샘플 있습니다.

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

연구

의학

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

원격 높은 처리량 Phenotyping에 마우스 눈 핵의 제거

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

쥐 심근 경색을 유도 최소 침습 수술

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

신경 보호 전략에 대한 치료 요인의 납품을위한 설계 성인 줄기 세포의 높은 처리량 특성

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

인간 A53T를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 ELISA에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 CSF 분석은 퇴행성 신경 바이오 마커 및 아포 지단백 E 이소 상태를 정량화하기

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to insulin-stimulated glucose uptake and a gross decompensation of systemic glucose metabolism. Despite considerable progress in the understanding of glucose metabolism, the molecular mechanisms of its regulation in health and disease remain under-investigated, while novel approaches to prevent and treat diabetes are urgently needed. Diet derived glucose stimulates the pancreatic secretion of insulin, which serves as the principal regulator of cellular anabolic processes during the fed-state and thus balances blood glucose levels to maintain systemic energy status. Chronic overfeeding triggers meta-inflammation, which leads to alterations in peripheral insulin receptor-associated signaling and thus reduces the sensitivity to insulin-mediated glucose disposal. These events ultimately result in elevated fasting glucose and insulin levels as well as a reduction in glucose tolerance, which in turn serve as important indicators of insulin resistance. Here, we present a protocol for the generation and metabolic characterization of high-fat diet (HFD)-fed mice as a frequently used model of diet-induced insulin resistance. We illustrate in detail the oral glucose tolerance test (OGTT), which monitors the peripheral disposal of an orally administered glucose load and insulin secretion over time. Additionally, we present a protocol for the insulin tolerance test (ITT) to monitor whole-body insulin action. Together, these methods and their downstream applications represent powerful tools to characterize the general metabolic phenotype of mice as well as to specifically assess alterations in glucose metabolism. They may be especially useful in the broad research field of insulin resistance, diabetes and obesity to provide a better understanding of pathogenesis as well as to test the effects of therapeutic interventions.

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

The current article describes the generation and metabolic characterization of high-fat diet-fed mice as a model of diet-induced insulin resistance and obesity. It further features detailed protocols to perform the oral glucose tolerance test and the insulin tolerance test, monitoring whole-body alterations of glucose metabolism in vivo.

높은 지방 다이어트를 먹이 쥐 경구 포도 당 내성 검사 (OGTT)과 인슐린 내성 검사 (ITT)를 사용 하 여 포도 당 대사 Vivo에서 의 연구

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

급성 심근 경색 및 심혈 관 질환 MicroRNAs 순환 측정을 위한 디지털 PCR

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...