This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).

주 :이 프로토콜은 FRET의 사용은 마우스 생물학적 시료에서 시딩 활성을 검출하기위한 유세포 강조한다. 또한, 피 브릴과 재조합 인간 생물학적 시료와 호환된다. 마우스를 안락사 뇌 수확은 IACUC 승인 절차에 따라 수행 하였다. 1. 뇌 추출 <ol><li> 이소 플루 란 (2 %)와 깊은 마취를 따르는 것은, 얼음처럼 차가운 PBS는 0.03 %의 헤파린을 포함와 마우스를 관류하고, 게이지 등에 기술 된 사항은 다음 뇌의 압축을 풉니 다. (18) </li><li> 극저온 유리 병에서 추출한 조직을 배치하고 액체 질소에 배치하여 동결 웁니다. 또한, 드라이 아이스에 조직을 동결. 일단 필요한 경우, 장시간 동안 -80 ° C에 저장 조직을 전송 냉동. 참고 :이 프로토콜은 전체 뇌 균질 또는 마이크로 해부 뇌 영역과 호환됩니다. Hagihara 등의 알을 참조하십시오. 자세한 마이크로 해부 프로토콜 19. </li></ol&gt; 생물 종자 소재 2. 준비 <ol><li> 1X의 TBS (10 ㎖ 당 1 정제)에 단백질 분해 효소 억제제를 (무료 EDTA)을 용해하여 균질화 버퍼를 준비합니다. 얼음에 적극적으로 소용돌이 및 저장. 단백질 분해 효소 억제제는 바이오 센서 세포 생존을 유지하기 위해 EDTA가 없어야합니다. </li><li> 일회용 무게 보트에 고정 된 뇌 조직의 무게를 측정하고, 5 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다. 최종 솔루션은 10 % 중량 / 부피가되도록 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼를 추가합니다. 일시적으로 얼음에 저장합니다. 조직 덩어리와 후속 균질화 완충액 용적 사용 뇌의 크기 및 / 또는 지역에 따라 달라질 것이다. 여기에, 0.2 g의 무게 성인 마우스 hemibrain은 10 % W / 부피 솔루션 2 ㎖에 일시 중단됩니다. </li><li> 전송 추운 방에 샘플 및 적절한 설정으로 프로브 초음파기를 조정합니다. (여기에 도시 된) 옴니 Ruptor과 초음파 프로브의 경우, 샘플이 OV되지 않도록 약 75 W. 사용하여 펄스 모드에 해당하는 20 %로 전력을 설정할초음파 동안 ER-가열. 약 500 밀리 초에 해당하는 30 % 펄스 발생기를 설정합니다. </li><li> 다시 물, 이소프로판올, 물과 린스 각 솔루션 사이에 프로브를 닦아 프로브 소니 케이의 끝을 청소합니다. 씻어 측면과 실험실 와이프와 프로브의 바닥을 모두 닦아 특정합니다. </li><li> 한번에 하나의 샘플로 작업, 균질화 완충액에 프로브 팁 잠수함 및 초음파기를 시작한다. 전술 한 전력과 펄서 설정을 사용하여 총 25 펄스를 제공한다. 그 조직이 서스펜션에 완전히 확인합니다. 이 단계에서 샘플의 거품을 피하기 위해주의해야합니다. 주 : a) 총 부피가 낮은 또는 B)가 파쇄 예열하면 샘플이 발포에 민감하다. 이 특정 악기로, 250 μL 미만의 볼륨과 초음파 처리하지 않습니다. 샘플이 냉각 유지되도록하기 위해, 튜브는이 단계 동안 얼음 상에 저장 될 수있다. </li><li> 잔류 해물을 멀리 닦아 프로브를 청소 한 다음 비커 오에 (10) 펄스를 제공F 깨끗한 물. 각 단계 사이에 건조 와이 핑 (단계 2.4에서와 같이) 양쪽 다시 물, 이소프로판올, 물과 프로브의 바닥을 헹군다. 오염을 방지하기 위해 철저하게 샘플 사이에 프로브를 헹군다. 주 : 타우 응집체, 우리는보다 엄격한 세척 방법은 샘플 간 오염을 방지하기 위해 필요한 것을 발견되지 않았다. 기타 아밀로이드 그러나, 광범위 문학 (20, 21)에 설명 된 추가 치료가 필요할 수 있습니다. </li><li> 모든 샘플이 처리 될 때까지 얼음 상에 저장 균질. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 21,300 XG에서 균질 스핀. </li><li> 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 깨끗한 튜브에 뜨는을 전송합니다. 펠렛을 폐기하십시오. 상기 용도 -80 ° C에서 상등액 및 저장 용 해물 나누어지는. 이 시딩 효율을 감소시키기 때문에, 그러나, 균질의 동결 / 해동 사이클을 피하십시오. </li></ol> 3. R​​eplating 바이오 센서 세포 노트:이 분석을 위해 네 개의 세포주를 사용하여 HEK 293T (셀 라인 # 1), RD-P301S-CFP (셀 라인 # 2), RD-P301S-YFP (3 세포주 #) 및 RD-P301S-CFP / YFP ( 세포주 # 4). 분석 각 세포주의 공헌은 표 1을 참조하십시오. <ol><li> 무균 환경에서, 흡 배지. 따뜻한 PBS 및 기음과 세포를 씻어. 를 Trypsinize 셀 3 분간 (트립신 EDTA (0.05 %) 3 mL)를, 따뜻한 배양 배지 (DMEM 9 ㎖, 10 % FBS, 1 % 펜 / 패 혈성, 1 % 루타)로 급냉하고, 즉시에 셀을 전송할 원뿔 튜브. </li><li> 실온에서 5 분 1,000 XG에 원심 분리기 세포. 대기음 매체와 따뜻한 문화 매체에 resuspend 세포 펠렛. </li><li> 혈구를 이용하여 각 세포주에 대한 세포 밀도를 결정한다. 세포 밀도는 수확 및 재 부유 볼륨시 포화 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 세포 밀도, 10 ㎖ 배지에서 90 % 컨 플루 언시 10cm 접시에서 수확 재현 탁 된 세포를 약 1 백만 세포 / ml이어야한다. </li><li> 하다세포의 마스터 믹스 + 미디어는 96 웰 플레이트의 각 웰을 130 ㎕의 매질에서 35,000 세포 포함될 것이다 (100 웰위한 마스터 믹스를 만들기 위해, 예를 13 ml의 배지에서 350 만 세포를 재현 탁). 각각의 실험적인 디자인과 일정에 맞게 휴대폰 번호를 수정합니다. 세포 처리를 위해 도금 후 ~ 18 시간은 96 웰 플레이트에 35,000 세포를 추가한다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 천천히 평평한 바닥의 각 웰에 마스터 믹스 세포 현탁액 130 μl를 피펫, 96 웰 조직 배양 플레이트를 처리. 도금하는 동안, 플레이트의 바닥에 닿지 않으면, 웰의 중심에 피펫 팁을 배치했다. 주 : 도금 포맷이 변경 될 수 있지만, 세포주 접시 당 1-3의 각각에 대해, N = 4 웰을 만드는 것이 권장된다. 플레이트 (N = 84)의 나머지 세포주 # 4 (바이오 센서 셀)를 위해 예약된다. </li><li> 세포가 실온에서 10 분 동안 그대로 접시를 남겨 정착하도록 허용합니다. 37 ° C, 5 % CO 2, 및에서 O / N을 부화# 8805; 80 % 상대 습도. </li></ol> 4. 치료 세포 참고 : 다음 날, 타우 바이오 센서 세포가 다음과 같이 종자 전달 복합체를 제조, 60~65% 합류 있습니다 : <ol><li> 하나의 튜브에서, 마스터 믹스를 만드는 등의 Opti-MEM과 같은 감소 된 혈청 배지와 같은 리포 펙 타민으로, 형질 감염 시약을 결합한다. 당은 물론, 1.25 μL 형질 전환 시약 및 8.75 μL 감소 혈청 미디어를 추가 할 수 있습니다. 톡 튜브 부드럽게 짧게, 혼합 스핀 다운, 그리고 실온에서 5 분 동안 품어합니다. </li><li> 다른 관에서, 감소 된 혈청 미디어 시드 물질 (단계 2.9에서 해물의 분취 량)을 결합한다. 참고 : 씨앗 재료의 볼륨은 개별 실험에 따라 달라질 수 있습니다. 종자 볼륨을 선택할 때, 고려 : 샘플과 잠재적 인 독성 씨의 풍부. 원유 균질 세포에 독성이 될 수 있습니다. 따라서, 원하는 효과를 모니터링 할 수 가장 낮은 볼륨을 사용합니다. 해물 / 웰 범위 FR의 이전 테스트 볼륨5 ~ 20 μg의 총 단백질에 해당하는 톰 1-5 μL. 물론 당 전체 볼륨 (씨앗 + 감소 혈청 미디어) 10 μL 있는지 확인하십시오. </li><li> 적어도 20 분 동안 2 시간까지 실온에서 간단하게, 부드럽게 혼합 4.1 및 4.2, 영화에서 설명하는 두 개의 튜브에서 내용을 결합 (1,000 XG, 5 초)를 스핀 다운, 그리고 품어. </li><li> 부드럽게 개별 바이오 웰의 측면에 전달 복합체의 20 μL 피펫. 세 기술 복제, 가능하면 사용하십시오. 24 ~ 48 시간 동안 인큐베이터에 처리 된 세포를 돌려줍니다. 단계 3.6에 기재된 것과 동일한 조건 하에서 배양한다. 참고 : 인지질의 응용 프로그램이 리포좀 시약에 노출되지 않은 세포를 바이오 센서에 형광 프로파일 상대적으로 약간의 변화를 소개하고 있기 때문에이 설정에 대한 적절한 음성 대조군 조건은 빈 리포좀 (즉, 리포좀 시약 + 감소 혈청 미디어)로 처리 바이오 센서 세포이다. </li></ol> FRET 유동 세포 계측법 5. 수확 세포 <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 참고 : 세포 - 일반적으로 수확하기 전에 24 ~ 48 시간 후 치료가 표준 반전 형광 현미경에 GFP 필터를 사용하여 파종 활동의 예비 판독을 얻을 수 있습니다. 시드 물질로 처리 된 세포가 강렬한 반점과 망상 세포 내 흠 (- B 그림 1A)를 보여줍니다 반면 시드 물질 (즉, 빈 리포좀)없이 처리 된 세포는 확산 형광 표시됩니다. <ol><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 모든 세포 배지 (150 μL)를 대기음. 를 Trypsinize (50 μL)에서 5 분 동안 세포를 150 ㎕의 냉각 된 배양 배지로 켄 칭한다. 이 셀 리프팅과 이후의 세포 손실이 발생할 수 있으므로,이 단계에서 트립신하기 전에 PBS 린스를 포함하지 마십시오. 게이팅 전략을 통해 유동 세포 계측법 중에 오염 죽은 세포와 파편을 제외합니다. </li><li> 즉시 5 마일 1,000 XG에서, 전송 96 웰 둥근 바닥 플레이트 세포와 원심 분리기를 담금질 후실온에서 N. </li><li> 대기음은 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 매체를 버리고. </li><li> 온화하지만 충분히 50 μL를 2 % 파라 포름 알데히드에서 세포 펠렛을 재현 탁하고, 10 분 동안 배양한다. 고정이보다 깨끗하고 일관된 결과를 제공하지만 다른 방법으로, 실행 세포는 살고있다. </li><li> 실온에서 5 분 1,000 XG에 원심 분리기 세포. 대기음은 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서, 파라 포름 알데히드를 버리고. </li><li> 온화하지만 충분히 완충액 200 μL 계측법 냉장 유동 세포 펠렛을 재현 탁 (HBSS, 1 % FBS, 1 mM의 EDTA) 및 세포 응집을 피하기 위해 가능한 한 빨리 실행 판. </li></ol> 6. FRET 유동 세포 계측법 참고 : 레이저 라인 필터 세트 (표 2) FRET 호환 장착되어 MACSQuant VYB, 같은 사이토 흐름을 사용합니다. 이 섹션 내에서 각 단계의 경우, 소프트웨어의 96 웰 템플릿을 사용하여 관심의 복지를 클릭 클릭&quot;재생&quot;샘플 이해와 흐름을 시작합니다. &#39;새로운 분석 창&#39;아이콘을 클릭하여 플롯 또는 통계 테이블을 확인합니다. X 또는 Y 축 중 하나의 제목을 클릭하고 적절한 필터를 선택하여 개별 이변 량 플롯에 축 매개 변수를 변경합니다. 세포 집단 또는 형광 신호를 교대로 증가 또는 적절한 필터와 연관된 전압을 감소시킨다. 이 악기로, 정확한 단일 셀 모니터링을 보장하기 위해 &lt;1000 이벤트 / 초를 실행합니다. <ol><li> 세포 인구가 왼쪽 사분면가 될 때까지 사이드 스 캐터 영역 앞으로 캐터 지역 (FSC-A) 이변 량 플롯 대 (SSC-A) 및 셀 라인 # 1 실행으로는, SSC 및 FSC 전압을 조정합니다. 다각형 도구를 클릭하고 세포 인구 (문 P1)을 정의합니다. 모든 게이팅 매개 변수의 그림 2를 참조하십시오. </li><li> FSC-H (높이) FSC-이변 량 플롯 대를 확인하고 그래프 위의 &quot;라이브&quot;를 클릭하고, P1을 선택하여이 음모에 게이트 (P1)을 적용합니다. 세포주 # 1실행, 다각형 도구를 클릭 한 단일 세포 (게이트 P2)를 정의합니다. </li><li> CFP, YFP 및 FRET : 3 히스토그램 플롯, 관심있는 필터의 각 하나를 확인합니다. 그래프 위의 &quot;라이브&quot;를 클릭하고, P2를 선택하여 이러한 플롯의 모든 게이트 (P2)를 적용합니다. 세포주 # 1 실행으로 전압을 조정하도록 CFP, YFP의 중간 세포 인구 및 히스토그램은 405 nm의 레이저로 세포를 자극, CFP과 FRET을 측정하고, 함께 캡처 형광 모든 0과 1이다 FRET 각각 50분의 450 nm의 50분의 525 nm의 필터. YFP를 측정하기 위해, 50분의 525 nm의 필터와 488 nm의 레이저 캡처 형광으로 세포를 자극. 레이저 및 필터 설정은 상기 표 2에 기재되어있다. </li><li> FRET와 YFP 채널로 CFP의 유출에 대한 보상을 수행합니다. 주 : 보상 형광 파급 보정 과정이다. 하나의 형광 색소의 형광 방출은 필터 DESI 내에서 검출 될 때마다 형광 스필 오버가 발생다른 형광 색소에서 신호를 측정 할 수 gned. 적절한 보상, CFP 파급 형광 FRET과 YFP 채널로부터 제거 될 수있다. 참고 : 보상이 모두 형광 양성 및 -negative 세포의 존재를 필요로한다. 따라서, CFP 양성 세포 (셀 라인 # 2), 실행하기 전에 샘플에 추가해야합니다 음성 세포 (1 세포주 #)를 보상합니다. <ol><li> 잘 세포주 # 2 서스펜션의 200 μL에 하나의 세포 라인 # 1 현탁액의 30 μL의 스파이크 보상 직전. </li><li> &quot;장비 설정&quot;아이콘을 한 후 &#39;보상&#39;탭을 클릭하고 보정 테이블을 열 &#39;매트릭스&#39;를 선택합니다. </li><li> 단계 6.3에 설명 된대로, CFP-이변 량 플롯 대 무서워-을 확인하고 게이트 (P2)를 적용합니다. 세포주 1 + 2 실행으로, &#39;상한&#39;아이콘을 클릭하고 같은 형광 -negative 및 양성 집단이 낮은 두 개의 사분면으로 구분됩니다 (빌 게이츠 LL3의 사분면을 그립니다차 LR3, 각각). </li><li> LL3과 LR3 게이트에 대한 FRET의 평균 형광 강도 (MFI)를 표시하는 통계 테이블을 만듭니다. FRET 신호의 MFI가 LL3과 LR3 사이의 동등한 때까지 보상 매트릭스의 FRET 매개 변수를 조정합니다. 이 단계에 이어, FRET 신호의 MFI는 FRET 채널로 스필 CFP의 부재를 시사 흠 세포 및 CFP 양성 세포 사이에서 동일하다. </li><li> 단계 6.3에 설명 된대로, CFP-이변 량 플롯 대 YFP-을 확인하고 게이트 (P2)를 적용합니다. 단계 6.4.3에서 수행 한 것과 유사한 사분면 (LL4과 LR4)를 그립니다. </li><li> LL4과 LR4에 대한 YFP의 MFI를 표시하는 통계 테이블을 만듭니다. YFP 신호의 MFI가 LL4과 LR4 사이의 동등한 때까지 보상 매트릭스의 YFP 매개 변수를 조정합니다. 이 단계에 이어, YFP 신호의 MFI는 YFP 채널에 CFP 스필의 부재를 시사 흠 세포 및 CFP 양성 세포 사이에서 동일하다. </li></ol></li><li> FOLL게이트 설치 및 보상 때문에, 관심의 우물을 선택하고 판의 나머지 부분을 실행합니다. </li><li> 모든 샘플은 &#39;파일&#39;다음 &#39;복사&#39;를 클릭하여, 수출 데이터 파일을 실행 한 후. , &#39;데이터 파일&#39;탭을 선택 실험 폴더를 선택하고 &#39;복사&#39;를 클릭합니다. </li></ol> 7. 데이터 분석 참고 : X 또는 Y 축 중 하나의 제목을 클릭하고 적절한 필터를 선택하여 개별 이변 량 플롯에 변경 축 매개 변수를 설정합니다. <ol><li> 분석 프로그램 유동 세포 계측법에서 열기 FCS 파일. </li><li> 산란 특성들에 기초하여, 유사 제 6 항에 기재된 것과, 빈 리포좀으로 처리 한 세포에서 (FSC-VS FSC-H) 세포 집단 (FSC VS SSC) 및 중항 인구를 정의하는 다각형 게이트를 사용한다. </li><li> CFP 보상을 설치하는 동안 수행 된 경우, 추가 CFP를 조정하지 않습니다. </li><li> YFP의 이변 량 플롯 대 FRET을 만듭니다. 세포주 # 3를 사용하여, FRET 양성 세포 인구의 경사를 따라 실행되는 다각형 게이트를 그려 거짓 무서워 게이트를 정의합니다. 이 게이트는 FRET 필터 내의 신호를 방출 YFP 단일 양성 세포를 제외하고 이전에 외 금지하여 도시 된 것과 유사 그려. 22 </li><li> CFP의 이변 량 플롯 대 FRET에 빈 리포좀 처리 CFP / YFP 세포를 플롯에 의해 무서워 게이트를 정의합니다. 위쪽으로 확장하고 멀리 인구에서 좌측으로 인구의 경사를 따라 다각형 게이트를 소개합니다. 이 게이트는 배경이 세포의 ≥1 %로 FRET 있도록 대부분의 세포 (~ 99 %)을 제외한다. 이 게이트로 이동 모든 이벤트는 FRET 양성 간주됩니다. 참고 : 위에서 설명한 각각의 게이트는 다음 게이트를 구성하기 전에 모든 샘플에 적용됩니다. 분석에 따라, 네 개의 개별 게이트가 정의 (세포 인구, 단일 거짓 무서워, 무서워). </li><li> %의 FRET 양성 및 MFI 등 : 관심의 기록 분석 매개 변수,FRET 양성 세포. 수동 퍼센트 양성 및 MFI의 생성물을 측정함으로써 FRET 집적 밀도를 계산한다. 주 : 집적 FRET 밀도 측정 결과는, 두 개의 개별 요소 미만인 곱을 계산 피하기 위하여 1보다 크거나 같다 및 MFI (단계 7.5에서 정의 된 바와 같이) 설정 배경 FRET로 사용되는 경우. </li></ol>

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X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+prion+protein+bound+to+stainless+steel+wires:+a+model+for+testing+decontamination+procedures+for+transmissible+spongiform+encephalopathies.">Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).</li><li>McDonnell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning,+disinfection+and+sterilization+of+surface+prion+contamination.">Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination.</a> J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).</li><li>Banning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+FRET+assay+to+identify+and+analyse+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells.</a> PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).</li><li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer's+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein.">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein.">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537 (2015).</li></ol>

This assay has been licensed to Janssen Pharmaceuticals.

여기에 설명 된 FRET 유동 세포 계측법 시스템은 신속하고 정량적 타우 파종 활동을 평가하기위한 강력한 도구입니다. 그것은 단지 적당한 세포 배양 경험과 FRET에 대한 실무 지식과 유동 세포 계측법을 필요로한다. 베타 시트 구조에 결합하면 형광을 강화 전시 - - 등 Thioflavin T와 같은 다른 시드 분석은, 수고하고 순수한, 재조합 단백질 기판을 필요로한다. 또한, 타우에 대한 시험 관내 시드...

세포 내 타우 아밀로이드의 축적은 알츠하이머 질환과 같은 퇴행성 신경을 정의한다. 초기 질병 단계에서, 병리학은 일반적으로 뇌의 이산 지역 언어로 번역되어 있지만, 질병의 진행과 함께, 병리는 변함없이 별개의 신경망 1-5을 따라 확산. 축적 증거가 독성 단백질 응집체의 세포 횡단 전파가 (6-10에서 검토)이 병리의 기초가 제안합니다. 이 모델에서, proteopathic 종자 (예 타우) 공여 세포로부터 방출되고, 주형 형태 변화 11-15 비아 미스 폴딩 형태로 네이티브 타우 단백질을 변형, 인접 셀 입력. 여기에 설명 된 분석은 이러한 민감 시딩 활성을 검출하기 위해 개발되었다. 그것은 재조합 단백질 및 생체 시료와 호환되며 proteopathic 시드 활동 16 분 수준의 정량화 할 수 있습니다. 안정적 타우 반복 D를 표현하는 HEK 293T 세포CFP 또는 YFP 하나에 융합 된 질병 - 관련 돌연변이 P301S 함유 omain (RD)는 시딩 활성의 안정적 바이오 센서로서 기능 (이하 타우 RD-CFP / YFP 셀이라 함). proteopathic 씨의 부재 하에서, 세포는 수용성 단량체로서 타우을 유지하고 뚜렷한 배경 FRET 없다. 세포에 자발적 흡수 또는 타우 씨의 리포좀 - 매개 형질 그러나, 유동 세포 계측법을 통해 단일 ​​세포 내에서 측정 FRET 신호를 생성 RD-CFP 및 RD-YFP 집계, 결과. 이 분석의 다수의 구성 요소는 감도를 향상시키고 변동을 줄일 수 있도록 설계되었다. 1 단일 클론 세포주 : 그것은 최적의 신호를 제공하기 때문에 1 RD-CFP / YFP 발현 비율이 선정되었다 : 소음. 감도를 높이기 위해, 인지질은 세포 내로 직접 도입하는 종자를 사용하는 (흡수 생물학적 메커니즘을 연구하는 있지만, 이는 생략 될 수있다). 마지막으로, 인구 수준 및 단일 셀에서 모니터 FRET 유동 세포 계측법<html> 레벨, 다른 단백질 응집 분석법 달리. 최종 결과 측정, FRET 집적 밀도가 높은 정량하고 응집 세포의 수, 각 집합은 셀 내에서 발생하는 정도 모두를 차지한다. 이러한 최적화는 모든 파라미터 감도 향상 및 재현성을 보장한다. 이 시스템은 최근에 일반적으로 사용되는 타우 병리학 마커 시간 발병과 타우 시드 활동 상대의 진행 (예를 들어, MC1, AT8, PG5 및 ThioflavinS)을 평가 형질 전환 P301S 타우 병증 마우스 (17)의 포괄적 인 연구에 사용 하였다. 시드 활동으로 지금까지 최소한 6 주까지 조직 학적 검색을 이전 평가 타우 병리학의 초기와 가장 강력한 마커입니다. 시드 활동 개시 및 / 또는 신경 퇴행 (16)의 진행에 proteopathic 씨의 인과 적 역할을 제안, 1.5 개월 점진적으로 연령 증가에 나타납니다. e_content &quot;&gt; 생물학적 시료에서 시드 물질의 미세한 수준의 정확한 정량. 초기 질병 진행을 모니터링 연구를 용이하게 할 수있는 시험 기간을 단축하고 어린 동물들의 사용을 가능하게함으로써,이 전임상 동물 실험의 효율성 및 정확성을 증가시킬 수있다. 예를 들면, P301S 마우스 전술 납 화합물은 초기 4~6주만큼 제공 될 수있는, 2-4 주 후에 효능을 모니터링. 분석 정확하게 파종 어떠한 감소를 정량화한다 (또는 시딩 활성의 발병 직전) 활성. 계측법 관내 스크리닝 응용뿐만. 예를 들어, 항 - 타우 시약 (예, 항체, 소분자 등) 중 재조합 타우를 사용하여, 배양에서 직접 유도 시드 차단하는 그들의 능력에 대해 신속하게 시험 될 수있다 흐름 FRET 시드 소스 (그림 5).이 설정으로, 씨앗 재료가 준비되면, 전으로 집계 또는 뇌 유래 해물periment 데이터 분석을 포함, 완료하는 데 사흘이 걸립니다. proteopathic 시딩 활성의 신속한 정량 따라서 신경 퇴행의 많은 연구를 용이하게 할 수있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XSE 105DU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Boats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-735-743</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>18-000-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>OR-T-156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noise Cancelling Ear Muffs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-145-412</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S47299</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 000.215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SS-PH15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL reagent resevoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>41428-954</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi channel pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TI13-690-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED2SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14185-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 40 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOLiner Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-116</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 96 Rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-459</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo analysis software</td>
			<td>Flow Jo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-606180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-607180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-760180</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sensitive detection of proteopathic seeding activity with fret flow cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

FRET 유동 세포 계측법에 민감한, 양적, 재조합 또는 생물학적 시료에서 파종 작업을 신속하게 검출 할 수 있습니다. 분석 설치가 용이 한 것입니다 : 타우-RD-CFP / YFP을 표현하는 단일 클론 유래 안정적인 세포주는 24 ~ 48 시간 동안 배양, 종자 물질로 형질 도입 및 분석 (그림 1A) 유동 세포 계측법의 대상이된다. 씨의 부재에서, 바이오 센서 셀 가용성, 단량체 형태 (도 1b) 타?...

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Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

FRET 유동 세포 계측법과 Proteopathic의 시드 활동의 민감한 검출

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

sensitive-detection-proteopathic-seeding-activity-with-fret-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K 조회수.  University of Texas Southwestern Medical Center. Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

연구

생체공학

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

휴대 전화에 폭 넓은 분야 형광 현미경과 형광 이미징 유동 세포 계측법

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법과 세포의 현지화 및 탄소 나노 튜브의 상대 정량

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

플로우를 통해 마이크로 반응기와 MS 검출을위한 단백질의 빠른 효소 처리

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정을 사용하여 시험관 내 미세핵 분석기를 능력을 발휘하는 자동화된 방법

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies for the detection of CTCs include flow cytometry, microfluidic devices, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Despite recent advances, methods for the detection of early ovarian cancer metastasis still lack the sensitivity and specificity required for clinical translation. Here, a novel method is presented for the detection of ovarian circulating tumor cells by photoacoustic flow cytometry (PAFC) utilizing a custom three dimensional (3D) printed system, including a flow chamber and syringe pump. This method utilizes folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (FA-CuS NPs) to target SKOV-3 ovarian cancer cells by PAFC. This work demonstrates the affinity of these contrast agents for ovarian cancer cells. The results show NP characterization, PAFC detection, and NP uptake by fluorescence microscopy, thus demonstrating the potential of this novel system to detect ovarian CTCs at physiologically relevant concentrations.

A protocol is presented to detect circulating ovarian tumor cells utilizing a custom-made photoacoustic flow system and targeted folic acid-capped copper sulfide nanoparticles.

광음향 유동 세포측정을 이용한 난소암 검출

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...