색색세포 기반 분석법을 사용하여 AAV에 대한 항체 중화를 검출하는 단계별 방법

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December 7th, 2021

DOI :

10.3791/63419-v

December 7th, 2021

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Sebastian Bass-Stringer¹^,², Colleen J. Thomas²^,³, Clive N. May³, Paul Gregorevic⁴, Kate L. Weeks¹^,⁵^,⁶, Julie R. McMullen¹^,²^,⁵^,⁶^,⁷

¹Baker Heart and Diabetes Institute, ²Department of Physiology, Anatomy and Microbiology, La Trobe University, ³Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne, ⁴Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR), The University of Melbourne, ⁵Department of Diabetes, Central Clinical School, Monash University, ⁶Baker Department of Cardiometabolic Health, The University of Melbourne, ⁷Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital, Monash University

필기록

AAV를 중화하는 기존의 항체는 AAV 유전자 치료의 발전에 장벽을 제기합니다. 이 분석은 AAV에 대하여 항체를 중화하는 것을 검출하는 검열 공구입니다. 가장 큰 장점은 비용 효율적이고, 시간 효율적이며, 설치가 용이하며, 최소한의 기술 력, 실험실 장비 및 시약이 필요하다는 것입니다.

사전 따뜻하게 된 완전한 DMEM 미디어에서 밀리리터 당 5 세포에 1 x 10의 농도로 세포를 희석하여 첫날HT1080 세포를 도금하기 시작합니다. 그런 다음 잘 당 세포의 100 마이크로 리터를 잘 96 잘 평평한 바닥 판으로 잘 1 x 10의 농도로 잘 한다. 16~22시간 동안 밤새 이산화탄소 5%를 37도에서 배양합니다.

둘째 날에는 사전 따뜻하게 된 완전한 DMEM을 사용하여 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 관심있는 혈청 샘플의 직렬 희석을 생성합니다. 희석혈청 샘플을 가진 각 관에, 마이크로리터 바이러스 작동 용액 당 6개의 바이러스 게놈에 7.5x10의 66 마이크로리터를 추가합니다. 피펫팅에 의해 바이러스 혈청 희석을 혼합한 다음 37°C의 인큐베이터에 바이러스 혈청 혼합물을 함유한 튜브를 5%의 이산화탄소와 30분 동안 배치하여 잠재적 중화가 발생할 수 있도록 한다.

30분 후, 바이러스 혈청 혼합물의 파이펫 100 마이크로리터는 1x10을 함유한 96웰 플레이트에 각각 잘 하여 1x10을 함유한 후, 플레이트를 호일에 싸서 16~24시간 동안 5%의 이산화탄소로 37도의 인큐베이터에 배치한다. 셋째 날에는 부착된 세포를 방해하지 않고 연기 후드 진공을 사용하여 96웰 플레이트의 우물에서 미디어를 흡인하고 각 우물에 4%의 파라포름알데히드 50마이크로리터를 첨가한다. 호일로 접시를 감싸고 나면 실온에서 10분 간 그대로 둡니다.

나중에 실온에서 PBS 200 마이크로리터로 세포를 두 번 세척하고 흡입합니다. 두 번째 세척 후, 파이펫 200 마이크로리터의 미리 따뜻해진 PBS를 각 우물로 감싸고, 90분간 65도에서 배양한 후 내생 알칼리성 인산염 활성을 제거한 후, 새로 준비된 BCIP/NBT의 50 마이크로리터에서 각 웰및 2시간 동안 2시간 동안 2시간 동안 쿠베이에 싸여 있습니다. 나중에, 모든 에세이에 대해 동일한 노출, 흰색 밸런싱 및 빛 설정을 일관되게 사용할 수 있도록 가벼운 현미경 카메라에서 4X 목표 렌즈를 사용하여 각 우물의 사진을 찍습니다.

ImageJ에서 이미지를 분석하려면 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다. 컬러 이미지의 경우 이미지, 유형 및 8비트 탭을 순서대로 선택하여 회색 축척으로 변환합니다. 그런 다음 이미지 탭으로 이동하여 조정 및 임계값을 선택하여 모든 색상 영역이 빨간색으로 지정되고 빨간색이 아니라 배경이 지정되지 않을 때까지 임계값을 변경합니다.

측정 분석 및 설정을 클릭하고 지정된 신호 판독을 결정하기 OK.To 전에 영역, 영역 분획, 임계값 제한 및 표시 레이블에 대한 확인란을 선택하여 팝업 창의 백분율 영역 열에 신호 판독값을 표시하도록 분석 및 측정을 클릭합니다. 연구 결과는 바이러스 게놈의 사격량의 범위에서 세포에 있는 AAV6-hPLAP 기자 유전자를 추가하여 최적 바이러스성 복용량을 설치했습니다. 15, 000의 감염의 복합성은 36%의 플레이트 색화를 부여하고 최적의 바이러스 성 투여량으로 선택되었다.

대표적인 분석은 착색과 감염의 복합성 사이의 상관 관계를 표시합니다. 착색과 바이러스 농도 사이의 선형 상관관계에 영향을 미치지 않은 가장 높은 시험 농도가 얻어졌다. 로그 10 희석에서 아데노 어소시에이트 바이러스 또는 AAV6에 대한 항 AAV6 단일 클론 항체에 대한 중화 활성을 중화하는 연구는 밀리리터 당 10 나노그램의 농도에서 AAV6 트랜스듀션 또는 TI50의 50% 억제를 보였다.

중화 항체 또는 NAb 분석에서, AAV 중화의 정도는 1/2에서 1/80에 이르는 TI50 titre 값을 가진 순진한 견본 집단 내에서 변화하였다. 분석 결과는 AAV 투여 전에 AAV 억제 TI50 titre 값이 1/4에서 1/80까지 구역 수색했다는 것을 표시했습니다. AAV 투여 후 TI50 titre는 1/2000 사이로 증가하고 1/32, 000 이상으로 증가하여 AAV 이전 및 사후 관리 사이의 titre 값에서 명확한 대조를 보여 주어.

우물의 사진을 찍을 때, 지속적으로 분석 전반에 걸쳐 동일한 현미경 설정을 사용하고 또한 사진이 우물의 중앙에 직접 촬영되도록하는 것이 중요합니다.

요약

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