先前存在的中和AAV的抗体对AAV基因疗法的进步构成了障碍。该测定是一种筛选工具,用于检测针对AAV的中和抗体。主要优点是它具有成本效益,省时性,易于设置,并且需要最少的技术技能,实验室设备和试剂。
在第一天开始接种HT1080细胞,方法是在预热的完整DMEM培养基中将细胞稀释至每毫升1×10至第五个细胞的浓度。然后将每孔100微升细胞接种到透明的96孔平底板中,浓度为每孔1×10至第四个细胞。将板在37摄氏度下与5%二氧化碳孵育过夜16至22小时。
第二天,使用预热的完整DMEM在1.5毫升微量离心管中生成目标血清样品的连续稀释液。向每个具有稀释血清样品的试管中,向每个微升病毒工作溶液中的66微升7.5x10加入66微升病毒基因组。通过移液混合病毒血清稀释液,然后将含有病毒血清混合物的管子置于37摄氏度的培养箱中,其中5%二氧化碳30分钟,以允许潜在的中和发生。
30分钟后,将100微升病毒血清混合物移液到含有每孔1x10至第四个细胞的96孔板上的每个孔中,然后将板包裹在箔中,置于37摄氏度的培养箱中,用5%二氧化碳过夜16至24小时。在第三天,使用通风橱真空从96孔板的孔中吸出培养基,而不会破坏粘附的细胞,并向每个孔中加入50微升4%多聚甲醛。用铝箔包裹板后,在室温下放置10分钟。
之后,在室温下用200微升PBS洗涤并吸出细胞两次。第二次洗涤后,将200微升预热的PBS移液到每个孔中,并将板包裹在箔中,然后在65摄氏度下孵育90分钟以变性内源性碱性磷酸酶活性,然后在50微升下将新鲜制备的溶解的BCIP / NBT孵育到每个孔中,并在室温下孵育包裹的板2至24小时。之后,在光学显微镜相机中使用4X物镜拍摄每个孔的照片,确保在所有测定中始终如一地使用相同的曝光,白平衡和光设置。
要分析 ImageJ 中的图像,请选择该文件,然后单击"打开"。对于彩色图像,请按顺序选择"图像"、"类型"和"8 位"选项卡,转换为灰度。然后转到"图像"选项卡并选择"调整"和"阈值"以更改阈值,直到所有彩色区域都变为彩色和红色,但背景不是。
单击"分析和设置测量值",然后勾选"面积"、"面积分数"、"阈值限制"和"显示标签"复选框,OK.To 然后单击"分析和测量",然后单击"分析和测量",以便弹出窗口的"面积百分比"列显示信号读数。该研究通过在病毒基因组的一定浓度范围内的细胞中添加AAV6-hPLAP报告基因来确定最佳病毒剂量。15, 000的多重感染赋予36%的板着色,并被选为最佳病毒剂量。
代表性分析显示了着色与感染多样性之间的相关性。获得不影响着色与病毒浓度之间线性相关性的最高测试浓度。在对数10稀释时抗AAV6单克隆抗体或AAV6抗腺结合病毒或AAV6的中和活性的研究表明,在浓度为每毫升10纳克时,AAV6转导或TI50的抑制率为50%。
在中和抗体或NAb测定中,AAV中和程度在幼稚样品群体内变化,TI50滴度范围为1/2至1/80。测定结果表明,AAV给药前AAV抑制TI50滴度值范围为1/4至1/80。AAV给药后,TI50滴度增加到1/2000至大于1/32, 000之间,显示出AAV给药前后滴度值的明显对比。
在拍摄孔的照片时,重要的是在整个测定过程中始终使用相同的显微镜设置,并确保照片直接在孔的中心拍摄。