Gli anticorpi preesistenti che neutralizzano l'AAV rappresentano una barriera al progresso delle terapie geniche AAV. Questo test è uno strumento di screening per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro l'AAV. Il vantaggio principale è che è conveniente, efficiente in termini di tempo, facile da configurare e richiede competenze tecniche minime, attrezzature di laboratorio e reagenti.
Iniziare a placcare le cellule HT1080 il primo giorno diluendo le cellule ad una concentrazione di 1 x 10 alla quinta cella per millilitro in mezzi DMEM completi preriscaldati. Quindi seminare 100 microlitri di cellule per pozzo in piastre chiare a fondo piatto a 96 pozzetti alla concentrazione di 1 x 10 alle quarte cellule per pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica durante la notte per 16-22 ore.
Il secondo giorno, generare diluizioni seriali dei campioni di siero di interesse in tubi di microcentrifuga da 1,5 millilitri utilizzando DMEM completo preriscaldato. A ciascun tubo con campioni di siero diluiti, aggiungere 66 microlitri del 7,5x10 alla soluzione funzionante a sei genomi virali per microlitro. Mescolare la diluizione del siero del virus mediante pipettaggio e quindi posizionare i tubi contenenti le miscele di siero del virus in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 30 minuti per consentire la potenziale neutralizzazione.
Dopo 30 minuti, pipettare 100 microlitri della miscela di siero del virus per ogni pozzetto sulla piastra a 96 pozzetti contenente 1x10 alle quarte cellule per pozzetto, quindi avvolgere la piastra in un foglio da posizionare in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica durante la notte per 16-24 ore. Il terzo giorno, aspirare il fluido dai pozzetti della piastra a 96 pozzetti usando un aspirapolvere con cappa aspirante senza interrompere le celle aderenti e aggiungere 50 microlitri di paraformaldeide al 4% a ciascun pozzo. Dopo aver avvolto la piastra in un foglio, lasciarla per 10 minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, lavare e aspirare le celle due volte con 200 microlitri di PBS a temperatura ambiente. Dopo il secondo lavaggio, pipettare 200 microlitri di PBS preriscaldato in ciascun pozzetto e avvolgere la piastra in un foglio seguito da incubazione a 65 gradi Celsius per 90 minuti per denaturare l'attività endogena della fosfatasi alcalina, dopo l'incubazione a 50 microlitri del BCIP/NBT disciolto appena preparato in ciascun pozzetto e incubare le piastre avvolte a temperatura ambiente per due o 24 ore. Successivamente, scatta foto di ciascun pozzo utilizzando un obiettivo 4X in una fotocamera con microscopio ottico, garantendo l'uso coerente della stessa esposizione, bilanciamento del bianco e impostazioni della luce per tutti i test.
Per analizzare l'immagine in ImageJ, selezionare il file e fare clic su Apri. Per le immagini colorate, convertitele in scala di grigi selezionando le schede Immagine, Tipo e 8 bit in ordine. Quindi vai alla scheda Immagine e seleziona Regola e Soglia per modificare la soglia fino a quando tutte le aree colorate sono colorate e rosse ma lo sfondo non lo è.
fare clic su Analizza e imposta misurazioni e selezionare le caselle di controllo per Area, Frazione di area, Limite alla soglia e Visualizza etichetta prima di premere OK.To determinare la lettura del segnale di un determinato pozzo, fare clic su Analizza e misura in modo che la colonna dell'area percentuale della finestra popup visualizzi la lettura del segnale. Lo studio ha stabilito il dosaggio virale ottimale aggiungendo il gene reporter AAV6-hPLAP nelle cellule a una gamma di concentrazioni del genoma virale. Una molteplicità di infezioni di 15.000 ha conferito una colorazione della piastra del 36% ed è stata selezionata come dosaggio virale ottimale.
L'analisi rappresentativa mostra la correlazione tra colorazione e molteplicità di infezione. È stata ottenuta la più alta concentrazione testata che non ha influenzato la correlazione lineare tra colorazione e concentrazione virale. Lo studio dell'attività neutralizzante su un anticorpo monoclonale anti-AAV6 contro il virus adeno-associato o AAV6 alla diluizione log 10 ha mostrato un'inibizione del 50% della trasduzione AAV6 o TI50 ad una concentrazione di 10 nanogrammi per millilitro.
Nel test dell'anticorpo neutralizzante o NAb, il grado di neutralizzazione AAV variava all'interno della popolazione campione naïve con valori di titolo TI50 compresi tra 1/2 e 1/80. I risultati del test hanno indicato che i valori del titolo TI50 di inibizione AAV prima della somministrazione di AAV variavano da 1/4 a 1/80. Dopo la somministrazione di AAV, il titolo TI50 è aumentato tra 1/2000 e superiore a 1/32.000, dimostrando un chiaro contrasto nei valori di titolo tra la somministrazione pre e post-AAV.
Quando si scattano foto dei pozzetti, è importante utilizzare costantemente le stesse impostazioni del microscopio durante il test e assicurarsi anche che le foto siano scattate direttamente al centro dei pozzetti.
