리포솜을 가진 대부분의 연구는 모든 리포솜이 동일하다고 본질적으로 가정하는 대담한 기술에 의존합니다. 단일 리포솜을 연구함으로써, 중요한 불동성을 관찰할 수 있습니다. 여기에 제시된 단 하나 liposome 기술은 우리가 동시에 리포솜의 수백을 공부하고 그들의 규모 및 조성에 있는 불균일성을 검출하는 것을 허용합니다.
이 방법은 단백질 막 상호 작용과 같은 단일 리포솜 수준에서 다른 시스템을 연구하도록 쉽게 조정할 수 있다. 당신이 필요로하는 것은 형광으로 표시될 연구 화합물입니다. 이 비디오를 통해 연구원들에게 단일 리포솜 연구를 수행하는 방법에 대한 도구를 제공합니다.
우리는 분석이 다른 과학적 주제의 범위를 연구하기 위해 쉽게 수정 할 수 있다는 것이 분명하기를 바랍니다. 시작하려면 준비된 지질 주 138마이크로리터의 POPC와 120마이크로리터의 콜레스테롤을 신선한 유리 유리 바이알에 섞는다. 그런 다음 형광으로 표시된 지질 2개와 DSPE-PEG-비오틴 50마이크로리터 각각 500마이크로리터를 추가합니다.
유리 유리 병의 뚜껑을 느슨하게하고 1 ~ 2 분 동안 액체 질소에서 유리병을 고정 스냅. 냉동 건조기에서 하룻밤 동안 냉동 지질 혼합물을 lyophilize합니다. 아침에는 200 밀리미터 D-소르비톨 버퍼를 마른 지질에 1밀리리터를 넣습니다.
혼합물을 섭씨 45도로 가열하고 적어도 한 시간 동안 자기 교반에 노출시십시오. 그런 다음 유리병을 액체 질소에 담그고 현탁액이 완전히 얼어 붙을 때까지 기다립니다. 다음으로, 혼합물이 완전히 해동 될 때까지 냉동 서스펜션을 섭씨 55도에서 가열 욕조에 담급니다.
혼합물을 총 11개의 동결 해동 사이클에 노출시다. 그 후, 미니 압출 키트를 사용하여, 800 나노 미터 폴리 카보네이트 필터를 통해 한 번 리포솜 현탁액을 돌출. BSA의 1, 200 마이크로리터와 120 마이크로리터의 BSA 비오틴을 혼합합니다.
8웰 슬라이드에 혼합물 300 마이크로리터를 각 웰에 넣고 실온에서 20분 동안 슬라이드를 배양합니다. 슬라이드를 약간 기울이고 각 가장자리에서 배지를 흡인합니다. 즉시 세척각 웰에 HEPES 버퍼 300 마이크로리터를 추가합니다.
총 8회 잘 씻으시면 됩니다. 250 마이크로리터의 스트렙타비딘을 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 이전에 설명한 대로 8개의 세서히를 반복합니다.
현미경에 슬라이드를 놓고 현미경 조이스틱을 조정하여 챔버 표면에 집중합니다. 이는 유리 버퍼 인터페이스에서 증가된 레이저 반사 신호를 가이드로서 사용하여 쉽게 수행할 수 있다. 마이크로센심분리기 튜브에 20 마이크로몰라 총 지질을 함유한 희석 된 리포솜 육수의 마이크로리터 10 마이크로리터를 추가합니다.
챔버에서 마이크로센심분리기 튜브로 완충제 100마이크로리터를 옮기고 제대로 섞어 110마이크로리터를 챔버로 다시 옮킨다. 현미경의 밑에 챔버를 놓고 표면에 고정되는 리포솜을 관찰하기 위하여 리포솜 형광에서 신호를 검출할 수 있는 기본적인 현미경 설정을 이용합니다. 원고에 설명된 대로 현미경을 설정합니다.
리포솜에서 DOPE ATTO488 및 DOPE ATTO655 형광을 모두 이미지화하려면 여러 채널을 이미지합니다. 교차 흥분을 피하기 위해 각 채널이 순차적으로 이미지화되었는지 확인합니다. 예를 들어, 먼저 488 나노미터에서 흥미 진진하고 495 ~ 590 나노미터에서 방출을 읽는 것으로 하나의 이미지를 취하십시오.
그 후, 설정을 변경하고 633 나노 미터에서 흥미 진진한에 의해 또 다른 이미지를 가지고 있지만 660 ~ 710 나노미터에서 만 배출을 읽는다. 분석. 이미지 메뉴에서 색상을 선택하고 병합 채널 함수를 사용하여 두 채널의 복합체를 만듭니다. 두 개의 서로 다른 채널에서 이미지된 리포솜이 양호한 공동 지역화를 표시하는지 또는 보이는 드리프트가 발생했는지 관찰한다.
입자를 감지하려면 플러그인 메뉴를 열고 ComDet을 선택하고 파티클 을 클릭합니다. ComDet에서 설정이 올바른지 확인하고 확인을 누릅니다. 분석을 실행한 후 결과와 요약이 있는 두 개의 팝업 창이 표시됩니다. 결과 테이블에는 두 채널 간의 강도 비율이 포함되어 있습니다.
공동 지역화 데이터가 포함된 데이터 테이블 결과를 내보냅니다. 강도 비율 히스토그램에 가우시안 기능을 장착하고 평균 및 표준 편차를 추출합니다. 평균 및 표준 편차는 불균일성의 정도를 계산하는 데 사용할 수 있습니다.
50 나노미터 필터를 통해 여러 번 압출된 리포솜 제형을 준비한다. 형광 강도를 DLS의 크기 데이터와 비교하여 리포솜의 크기를 보정합니다. 이전과 동일한 실험 현미경 설정을 통해 교정 리포솜을 이미지화합니다.
교정 리포솜의 형광 강도의 제곱근 강도 히스토그램을 플롯한다. 히스토그램에 로그 노멀 분포를 맞추고 교정 리포솜의 평균 형광 강도를 기하학적 의미로 추출합니다. 제곱 근강도와 리포솜 크기 사이의 관계를 결정하기 위해 동적 광 산란 측정에서 얻은 평균 리포솜 직경을 제곱 근강도의 기하학적 평균으로 나누어 보정 계수를 계산한다.
조성 불균일성 실험에서 리포솜에 대한 제곱 근강도 값을 계산하고 보정 계수와 곱하여 이 두 직경을 변환합니다. 조성 불균일성 리포좀에 대한 직경의 함수로서 강도 비율 값을 플롯하여 약 50 나노미터에서 800 나노미터에 이르는 리포솜 의 집단에 대한 리포솜 크기의 함수로서 불균일성을 달성한다. 이 프로토콜에서, 리포솜의 성공적인 표면 고정은 회절 한강도 반점에 의해 표시된 챔버에 리포솜 용액을 첨가한 즉시 명백했다.
프레임당 300~400개의 리포솜의 밀도를 달성하기에 충분한 리포솜을 고정하는 것이 좋습니다. 밀도가 낮으면 데이터 분석시간이 더 많이 소요되는 반면 밀도가 높을수록 단일 리포솜을 구별하기가 어렵습니다. 전체 시야가 적절한 초점에 있지 않으면 샘플 플레이트가 기울어질 수 있습니다.
또한 리포솜이 크고 흐릿해 보이는 경우 챔버의 버퍼가 증발하고 표면이 건조되었을 수 있음을 나타냅니다. 강도 비율 히스토그램은 일반적으로 평균 비율 값 주위에 가우시안 분포를 드러낸다. 가우시안 분포에서 강한 편차가 관찰되는 경우, 약한 신호를 나타내는 리포솜의 하위 집합이 제외되었음을 시사하는 검출 감도 문제를 나타낸다.
강도 비율 히스토그램을 가우시안 기능으로 피팅한 후, 0.23의 불균일성 값의 정도는 앙상블의 평균 어금니 비율과 23% 이상 다른 인구의 32%로 변환되었다. 실험적 불확실성의 정량화는 0.1로 나타났다. 분석은 당신이 사용하는 재료보다 더 나은 되지 않습니다 그래서 높은 품질의 unilaminar 리포솜은 필수적이다.
따라서 이 것들을 준비할 때 동결 해동 주기를 떠나는 것과 같은 모서리를 자르지 마십시오. 이미지가 좋지 않으면 실험적인 불확실성이 높고 불균일성을 과대 평가하므로 집중력이 좋은 이미지를 얻는 데 시간이 걸릴 수 있습니다. 분석이 기본적으로 하는 일은 형광 라벨의 표면 밀도를 연구하는 것입니다.
이 형광 라벨이 회귀 된 지질에 있는 경우에, 이 분석은 약 납품을 위한 질 테스트 liposomes에 이용될 수 있습니다. 이 설정은 펩티드가 멤브레인에 결합하고 곡률을 감지하는 방법을 연구하기 위해 적용되었습니다. 이것은 펩티드가 세포 안쪽에 분류되는 방법을 통제하는 분자 단서에 연구원에게 유일한 통찰력을 주었습니다.
