이 프로토콜은 일차 마우스 망막 색소 상피 세포를 성공적으로 분리하는 쉽고 효율적인 방법을 설명합니다. 망막 색소 상피 세포는 광 수용체 세포를 유지하고 망막의 정상적인 기능을 보장하는 데 매우 중요한 역할을합니다. 우리 연구실은 외부 혈액 망막 장벽 및 연령 관련 황반 변성과 같은 관련 질병을 연구하는 중요한 도구로 일차 마우스 색소 상피 세포를 분리해 왔습니다.
쥐의 눈을 추출하려면 기관에서 승인한 방법에 따라 윤리적으로 쥐를 안락사시킨 다음 마우스를 멸균 언더패드에 놓고 안와 부위의 5/45 스타일 핀셋을 눌러 안구균을 핵으로 만들어 proptosis를 유도한 다음 핀셋을 눈 뒤쪽으로 옮기고 부드럽게 당겨 눈을 제거하여 시신경이 손상되지 않도록 합니다. 집게를 사용하는 동안 5 % 포비돈 요오드가 들어있는 2 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 눈을 담그십시오. 실온에서 2-3 분 동안 눈을 배양하십시오.
포비돈 요오드에서 눈을 제거하고 페트리 접시에 넣으십시오. 멸균 이송 피펫을 사용하는 동안 포비돈 요오드의 주황색이 사라질 때까지 행크스의 균형 잡힌 식염수로 눈을 씻으십시오. 이것은 약 2-3 번의 세척이 필요합니다.
눈을 새로운 페트리 접시에 넣고 차가운 완전한 RPE 세포 성장 배지에 담그십시오. 거기에서 해부 현미경으로 해부를 시작할 수 있습니다. 현미경으로 핀셋 및/또는 Vannas 가위를 사용하여 외안근의 결합 조직을 당기거나 잘라냅니다.
그런 다음 차가운 RPE 세포 배양 배지에서 한 시간 동안 눈을 유지할 수 있습니다. 그러나 안구를 청소 한 후 다음 단계로 바로 진행하는 것이 좋습니다. 눈을 효소 A 용액이 들어있는 2 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮긴 다음 섭씨 37 도의 인큐베이터 내부에서 40 분 동안 눈을 배양합니다.
효소 A 용액에서 눈을 제거하고 효소 B 용액이 들어있는 새로운 2 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 넣은 다음 인큐베이터 안에 넣고 섭씨 37도에서 50 분 동안 배양합니다. 효소 B에서 눈을 제거하고 60mm 페트리 접시에 넣고 담그고 RPE 세포 성장 배지를 완성한 다음 섭씨 4도에서 30분 동안 눈을 배양합니다. 접시를 해부 현미경 아래에 놓고 해부를 시작하십시오.
M5S 집게와 주사기 바늘을 사용하여 오라 세라타 섹션을 절개하십시오. 이제 두 개의 집게로 한 집게로 절개 부위의 안쪽 부분을 잡고 다른 집게로 각막을 잡습니다. 각막을 당겨 망막에서 각막을 천천히 찢기 시작하십시오.
각막을 제거 할 때 조금씩 찢어지고 눈물을 아래로 이동하십시오. 이렇게 하면 RPE가 거의 손상되지 않고 더 깨끗한 찢어짐을 얻을 수 있습니다. 각막이 완전히 분리되면 홍채와 수정체를 볼 수 있습니다.
조리개와 렌즈를 겸자로 제거하여 분리의 순도를 유지하십시오. RPE 층에서 신경 망막을 제거하려면 하나의 핀셋으로 아이컵의 바깥층을 잡고 RPE와 신경층 사이에 두 번째 핀셋의 암을 배치합니다. 거기에서 RPE 층에서 신경 망막을 부드럽게 당기거나 퍼낸 다음 신경 망막을 버립니다.
RPE 레이어를 이물질이 없는 접시의 다른 위치로 이동합니다. 맥락막 및 공막에서 RPE를 분리하려면 5/45 스타일 핀셋으로 아이컵 내부를 부드럽게 긁어 RPE 세포를 분리합니다. RPE 세포는 현탁되고 완전한 RPE 세포 성장 배지일 때 흐릿하게 나타납니다.
3.2밀리리터 멸균 이송 피펫을 사용하여 세포를 흡입하고 완전한 RPE 세포 성장 배지가 들어 있는 새로운 15밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포는 실온에서 10분 동안 300g에서 원심분리될 수 있다. 그런 다음 상청액을 흡인하고 예열된 RPE 세포 성장 배지에 펠릿을 재현탁할 수 있습니다.
세포를 100mm 페트리 접시에 담고 섭씨 37도 및 5%CO2에서 배양합니다. 이들 이미지는 계대 0 및 계대 1에서의 성공적인 분리를 보여주며, 이는 RPE 세포의 색소침착에 의해 명백하다. 계대 4에서 세포는 덜 특징적이되고 안료가 적거나 스핀들과 같은 모양을 나타내거나 더 큰 표면적으로 더 견고 해집니다.
우리는 RPE 특이적 마커인 RPE65와 세포골격 단백질 F-액틴으로 RPE 세포를 검증했습니다. 또한 뮬러 세포 특이적 마커인 비멘틴(vimentin)으로 염색하여 뮬러 세포의 오염 가능성을 확인했습니다. 이 프로토콜은 기존 프로토콜을 단순화 한 것입니다.
이 프로토콜은 대부분의 연구실에서 사용할 수 있는 재료 및 관련 장비를 사용하므로 일차 마우스 RPE 세포를 효과적인 방식으로 분리하는 데 도움이 됩니다.
