RPE 관련 장애는 혼합 질환의 주요 부분으로 남아 있지만 RPE 관련 장애의 생리학적 및 병리학적 연구를 위한 좋은 모델로 작용하기 위해 1차 RPE 세포의 가상 배양에 효과적인 잔재가 없습니다. 이 프로토콜에서 우리는 1차 IPC를 배양하기 위해 따르기 쉬운 프로토콜을 제공하여 나중에 RP 특성을 신속하게 복원하고 유지할 수 있으며, 이 방법을 사용함으로써 사람들은 RPE 장애에 대한 새로운 치료법의 개발을 촉진할 수 있는 macistate 연구 및 보호 약물 스크리닝에서 RP 세포를 신속하게 생성할 수 있다고 믿습니다. 단계별 값 시연을 통해 RP 세포를 연구하려는 여러 실험실에서 이 방법을 훨씬 쉽게 복제할 수 있습니다.
조직 소화 효소 말라쿼드를 해동하기 시작하고 1X PBS를 멸균한다. 2 % 페니실린 및 2 % 스트렙토 마이신으로 보충 된 0.22 마이크로 미터 주사기 필터 장치를 통해 용액을 여과합니다. 배양 플레이트와 트랜스웰 삽입물의 웰을 1X PBS로 세척합니다.
피펫으로 웰 및 트랜스웰에서 PBS를 제거하고 하부 챔버에 1밀리리터의 신선한 1X PBS를 추가하고 상부 챔버에 밀리리터당 10마이크로그램의 라미닌 용액 600마이크로리터를 추가합니다. 플레이트와 트랜스웰 삽입물을 이 헬리컬처 인큐베이터에서 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 밤새 배양합니다. 그 후, 상부 챔버에서 라미네이트 용액을 제거하고 셀을 안착하기 전에 차가운 1X PBS 1 밀리리터로 두 번 세척하십시오. 라미네이트 흐름 후드를 75 % 에탄올과 자외선으로 청소하십시오.
약 25 밀리리터의 75 % 에탄올을 함유 한 3 개의 50 밀리리터 멸균 원심 분리 튜브, 약 25 밀리리터의 1X PBS를 포함하는 3 개의 50 밀리리터 멸균 원심 분리 튜브 및 약 15 밀리리터의 1X PBS를 포함하는 3 개의 10 센티미터 멸균 세포 배양 접시를 준비하십시오. 10 센티미터의 페트리 접시에 약 15 밀리리터의 75 % 에탄올에 4 개의 돼지 안구를 담그고 가위와 집게를 사용하여 모든 잔류 결합 조직과 근육을 잘라냅니다. 안구의 오염을 제거하기 위해 75 % 에탄올로 채워진 3 개의 50 밀리리터 멸균 원심 분리 튜브에 4 개의 안구를 담그고 순차적으로 씻으십시오.
그런 다음 1X PBS로 채워진 3 개의 50 밀리리터 멸균 원심 분리 튜브에서 안구를 순차적으로 씻으십시오. 매분마다 튜브를 뒤집어 안구를 철저히 씻으십시오. 4개의 안구를 1X PBS가 포함된 10센티미터 멸균 세포 배양 접시에 옮깁니다.
시신경과 작은 파편을 제거하기 위해 각 안구의 외부 표면을 다시 다듬습니다. 가위를 사용하여 윤부와 공막의 교차점에서 작은 절단을하십시오. 그런 다음 각막, 홍채, 수정체, 유리체 및 신경 망막을 제거합니다.
RPE 맥락막 공막 복합체를 새로운 10cm 세포 배양 접시에 옮기고 아이 컵을 4 잎 클로버 모양으로 평평하게하기 위해 4 번 자릅니다. 4개의 RPE 맥락막 공막 복합체를 새로운 10cm 접시에 넣고 20ml의 신선한 트립신 EDTA 용액을 부어 RPE 맥락막 공막 복합체를 병합하여 EDTA 용액 분해를 수행합니다. 접시를 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에 거의 30분 동안 놓습니다.
30 분 후, 인큐베이터에서 접시를 꺼내고 10 % FBS가 포함 된 예열 된 세포 배양 배지 20ml를 접시에 추가합니다. EDTA 용액에서 트립을 중화하려면 5밀리리터 전사 피펫을 사용하여 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 RPE 세포를 해리합니다. 세포 현탁액을 15 밀리리터 원심분리 튜브에 모은 다음, FBS로 또 다른 10 밀리리터의 신선한 배양 배지를 부드럽게 피펫팅하여 접시에 있는 RPE 맥락막 공막 복합체를 세척합니다.
실온에서 5분 동안 튜브를 300G으로 원심분리하여 RPE 세포를 수집합니다. 피펫을 사용하여 SuperAgent를 흡인하고 FBS로 배양 배지 5ml를 더 추가하여 세포를 다시 부유시킵니다. 300G에서 5 분 더 원심 분리합니다.
SuperAgent를 디캔트하고 12ml의 배양 배지로 세포를 다시 부유시킵니다. 다음 시드 100, 000 내지 200, 000 세포를 웰 당 12 웰 배양 플레이트 또는 트랜스웰 삽입물에 넣는다. 2 일마다 배양 배지를 교체하고 세포가 삽입 당 웰 표면을 완전히 덮을 때 혈청 농도를 1 %로 줄입니다.
세포가 수확 될 때까지 2 일마다 배양 배지를 교체하십시오. 2일차, 6일째 및 10일차의 1차 돼지 RPE 세포의 대표 이미지가 여기에 나와 있습니다. 일차 돼지 RPE 세포, 일차 인간 RPE 세포, ARPE 19 세포 및 돼지 RPE 맥락막 조직에서 시그니처 유전자의 mRNA 수준에 대한 QRTPCR 분석은 이 그래픽 이미지에 의해 검출됩니다.
여기서 GAP DH는 RTPCR을 위한 하우스키핑 유전자로서 사용되었다. 4개의 생물학적 복제물이 1차 돼지 RPE 세포에 사용되었고, RPE 19 세포에는 3개의 생물학적 복제물이 1차 인간 RPE 세포 및 돼지 RPE 맥락막 조직에 사용되었습니다. ARPE 19 세포에서의 유전자 발현 수준을 대조군으로 설정하였다.
ARPE 19 및 돼지 RPE 세포 및 일차 인간 RPE 세포 및 돼지 RPE 맥락막 조직에서 RPE 65 단백질의 웨스턴 혈액 분석이 이 그림에 나와 있습니다. Vinculin은 여기에서 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. 이 그림은 1%FBS를 갖는 DMEM 기본 배지에서 돼지 RPE 세포의 2주 배양을 보여줍니다.
라민과 함께 또는 라민없이 배양 된 세포를 RPE 65, 나트륨 칼륨 APTAs, Z01 및 Hex로 염색 하였다. 라미닌을 사용하거나 사용하지 않고 배양 된 세포 시트의 TR 측정이이 그림에 나와 있습니다. 일차 돼지 RPE 및 ARPE 19 세포에서 혈관 내피 성장 인자 또는 VEGF 및 색소 상피 유래 인자 또는 PEDF의 웨스턴 혈액 분석을 이 그림에 나타내었다.
배양된 1차 돼지 RPE 및 ARPE 19 세포의 부문별 기능이 이 이미지에 나와 있습니다. 이 프로토콜의 가장 큰 부분은 RPE chide glial 복합체에서 RP 세포를 용해시키는 것입니다. 매번 신선한 트립과 용액을 사용하고 소화 시간을 적절하게 조절하여 8개의 RP 세포를 용해시키는 것이 좋습니다.
