디지털 공간 프로파일링(DSP)은 공간적으로 계층화된 단백질 정량화를 위한 효율적인 방법을 제공합니다. 이를 구현하면 종양과 미세 환경의 별개 영역에서 단백질 발현을 특성화 할 수 있습니다. DSP의 주요 기능은 높은 처리량의 데이터 처리를 가능하게 하는 멀티플렉싱 기능입니다.
사용자 지정된 관심 영역을 정의하는 기능은 데이터 분석에 공간 차원을 추가로 제공합니다. DSP는 공간적으로 정량화하는 단백질 또는 RNA 발현이 병리학적 또는 생리학적 과정을 밝히는 데 도움이 될 수 있는 모든 샘플에 적용될 수 있습니다. 이것은 특히 지역 표적 변동성이 악성 성장 또는 침습과 관련이있을 수있는 종양학과 관련이 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 조직 공학자 인 Scott Palisoul과 게놈 기술자 인 Rachael Barney입니다. 슬라이드를 준비하려면 먼저 각 생검에서 여러 개의 2mm 코어를 가져와 단일 조직 마이크로 어레이 블록에 넣습니다. 블록에서 4 미크론 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 장착하십시오.
각 슬라이드를 슬라이드 홀더 개스킷 안에 넣고 섭씨 60도에서 30분 동안 배양합니다. 반자동 IHC 시스템에서 슬라이드 당 150 마이크로 리터의 세척 버퍼와 5 밀리리터의 데드 볼륨으로 위치 1의 용기를 채우고 뚜껑을 열어 둡니다. 용기의 위치 2에 동일한 양의 차단 용액을 채 웁니다.
시약 용기 트레이를 기계에 로드합니다. 프로세스 IHC를 선택한 다음 마커 필드의 드롭다운 상자에서 차단 솔루션 이름을 선택합니다. 모든 슬라이드에 대해 완료되면 닫기를 클릭합니다.
그런 다음 레이블 인쇄를 클릭하고 모든 슬라이드 레이블이 아직 인쇄되지 않음을 선택하고 인쇄를 클릭합니다. 슬라이드 상단에 레이블을 부착합니다. 슬라이드를 슬라이드 트레이에 올려 샘플과 라벨이 위를 향하도록 합니다.
LED 버튼을 눌러 트레이를 내리고 기기가 슬라이드 스캔 및 인식을 시작하도록 합니다. 시작 버튼을 클릭하여 실험을 시작합니다. 주행이 완료되면 녹색으로 깜박이면 LED 버튼을 누릅니다.
기기에서 트레이를 제거하고 각 슬라이드에서 커버 타일을 조심스럽게 들어 올립니다. 슬라이드를 1X 인산염 완충 식염수에 넣습니다. 과도한 완충액을 제거하고 소수성 펜으로 각 조직 섹션의 윤곽을 그리며 소수성 장벽을 만듭니다.
슬라이드 당 각 항체의 8 마이크로리터를 첨가하고 버퍼 W를 사용하여 200 마이크로리터의 최종 부피에 도달함으로써 항체 PC 올리고 용액을 만든다. 이어서, 항체 PC 올리고 용액을 슬라이드에 적용하고, 슬라이드를 섭씨 4도에서 밤새 배양한다. 배양 후 슬라이드를 가습 트레이에 넣고 1X TBST에서 10분 동안 세 번 세척합니다.
실온에서 30분 동안 4%파라포름알데히드에 사후 고정한 후 1X TBST에서 5분 동안 두 번 세척합니다. 실온에서 15분 동안 SYTO 13 핵 염색을 첨가한 다음, 1X TBST로 2회 세척하였다. 제어 센터의 데이터 수집 위에 마우스를 놓고 새로 만들기 또는 계속 실행을 선택합니다.
레이블이 사용자를 향하도록 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 트레이 cl을 내립니다.amp 길쭉한 창에서 조직이 보이도록 합니다. 6밀리리터의 버퍼 S를 추가합니다.제어 센터의 지시를 따릅니다.
x 및 y 슬라이더로 여러 축 사이를 확대하여 스캔할 영역을 표시합니다. 스캔(Scan)을 선택하고 정의된 전체 대상 영역이 이미징될 때까지 스캔을 진행합니다. 20 번 이미지를 생성합니다.
각 조직 코어에 대해 직경이 250마이크로미터인 동일한 크기의 원형 ROI 3개를 선택하여 ROI를 정의합니다. 스캔 작업 영역 종료 버튼을 클릭하여 ROI를 승인합니다. 그런 다음 UV 광선이 항체에서 올리고를 절단할 때까지 기다립니다.
장비 청소 프로세스를 완료한 후 새 데이터 수집을 선택하여 현재 슬라이드 또는 플레이트를 계속 진행합니다. 플레이트 아이콘 영역을 두 번 클릭하여 완성된 플레이트 창을 엽니다. 하이브리드화 코드 팩 로트 번호를 입력하고 업데이트를 클릭합니다.
그런 다음 완료를 클릭하십시오. 프롬프트에 따라 슬라이드 홀더와 수집 플레이트를 분리합니다. 슬라이드를 TBST에 보관하거나 수성 매체로 덮고 장기 보관을 위해 슬립을 덮으십시오.
투과성 씰을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 상단이 열린 상태에서 열 순환기에서 섭씨 65도에서 흡인물을 건조시킵니다. 7마이크로리터의 디에틸 피로카보네이트 처리된 물을 넣고 혼합합니다. 실온에서 10 분 동안 배양 한 다음 빠르게 회전시킵니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 방정식을 적용하는 적절한 프로브 R 및 프로브 U 방정식을 선택하여 프로브 버퍼 믹스를 준비합니다. 84마이크로리터의 프로브 버퍼 혼합물을 각 하이브리드화 코드 팩에 추가합니다. 새로운 96웰 하이브리드화 플레이트에서 각 하이브리드화 코드 마스터 믹스 8마이크로리터를 표시된 행의 12웰 모두에 추가합니다.
7 마이크로리터를 DSP 수집 플레이트로부터 하이브리드화 플레이트의 상응하는 웰로 옮긴다. 가열 밀봉하고 플레이트를 회전시킨 다음 섭씨 67도에서 밤새 배양합니다. 배양 후, 얼음 위에서 플레이트를 식히고 빠른 회전을 수행하십시오.
각 웰의 하이브리드화 제품을 스트립 튜브에 모으고 각 웰을 5회 부드럽게 피펫팅합니다. 스핀다운하고 스트립 튜브를 분석 시스템에 로드합니다. DSP 기기에서 CDF 파일을 USB 드라이브에 저장하고 데이터를 디지털 분석기로 전송합니다.
화면에서 처리 시작을 누릅니다. 고감도를 선택하고 다음을 선택합니다. 샘플이 있는 웰 수에 대해 모두 선택을 누른 다음 Finish(마침)를 누른 후 이메일 알림에서 다음을 누릅니다.
그런 다음 시작을 클릭하십시오. 준비 스테이션이 완료되면 카트리지를 밀봉하고 디지털 분석기로 옮깁니다. 계산 시작을 누릅니다.
스테이지 위치를 선택합니다. 기존 CDF 파일 로드를 누르고 이전에 업로드한 파일을 선택합니다. 완료를 누릅니다.
스테이지 위치를 다시 선택하고 완료를 누른 다음 시작을 눌러 프로그램을 실행합니다. 리포터 카운트 변환 파일의 ZIP 파일을 분석 시스템에서 USB 드라이브로 저장합니다. 드라이브를 DSP 시스템에 삽입합니다.
DSP 제어 센터에서 데이터 수집 위로 마우스를 가져간 다음 계정 업로드를 클릭합니다. 관련 ZIP 파일을 선택합니다. DSP 제어 센터에서 레코드를 클릭합니다.
대기열에서 스캔을 보려면 선택한 스캔을 대기열에 추가, 내 분석 대기열을 차례로 선택합니다. 제어 센터의 데이터 분석 옵션 위로 마우스를 가져가 대기열에서 새 스터디를 선택합니다. 교모세포종 샘플에 대해 DSP 실험을 수행하였고, 그 결과를 히트맵으로 시각화하였다.
행은 단백질 표적을 나타내며 각 열은 관심 영역에 해당합니다. 표현 수준은 낮은 표현을 나타내는 파란색에서 높은 표현을 나타내는 빨간색까지 다양한 색상 범위로 표시됩니다. 행 내 색상의 가변성은 지역 단백질 이질성을 반영하며 차등 단백질 발현과의 가능한 공간적 연관성을 시사합니다.
이 실험에서 S100과 CD-56은 신경 마커이기 때문에 보편적으로 높았습니다. 가장 가변성이 높은 마커에는 B7-H3, KI-67, CD-44 및 피브로넥틴이 포함되며, 이들은 종양 증식, 이동 및 전이와 관련된 것으로 알려져 있습니다. 광범위한 후보 대상 중에서 DSP는 상당한 지역적 차이를 보이는 대상을 식별할 수 있습니다.
이것은 변동성 및 질병과의 관련성과 관련된 요인을 조사하기위한 토대를 마련합니다.
