Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가

이 프로토콜은 종양 신경구의 3D 구조를 보존하는 방법에 의해 신경교종 바이오마커의 존재를 연구하는 데 사용될 수 있기 때문에 중요하다. 이 프로토콜의 주요 장점은 세포가 스트레스 조작을 실시하고 평평해지는 사이토스핀 방법에 비해 신경권의 형태가 유지된다는 것입니다. 이 방법은 세포가 3D로 배양되고 구조의 유지보수가 중요한 다른 조직 배양 시스템에 적용될 수 있다.

시작하려면, 세포가 수렴 될 때까지 T-25 플라스크에서 배양 종양 신경구 또는 NS. 15 밀리리터 원내 관에서 종양 NS를 선출한다. NS를 300 Gs에서 5분간 임펠트하십시오.

그 후, 펠릿을 10%의 포르말린 1밀리리터로 다시 중단하고 실온에서 10분 동안 튜브를 배양합니다. 다시 중단된 NS에 HBSS 5밀리리터를 추가합니다. 이전에 설명한 바와 같이 세포를 임펠트합니다. 펠릿이 들어 있는 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

2% 따뜻한 액체 아가로즈의 500 마이크로 리터에 세척 된 NS 펠릿을 다시 중단합니다. 그리고 부드러운 파이펫팅이나 교반으로 섞는다. 아가로즈가 중합될 때까지 아가로즈가 내장된 NS를 얼음 위에 놓습니다.

그런 다음 NS를 잡고 아가로즈 조각을 제거합니다. 아가로즈 조각을 조직 처리를 위해 카세트에 넣습니다. 수조를 섭씨 42도까지 설정합니다. 그리고 조심스럽게 마이크로 톤에 블레이드를 삽입합니다.

그런 다음 파라핀 블록을 마이크로토메에 넣습니다. 한 손으로 는 기계의 왼쪽에 있는 각 섹션의 두께를 제어하는 레버를 누릅니다. 레버를 두 번째 정지로 눌러 마이크로토메를 30 마이크로미터 두께로 설정합니다.

거친 손 바퀴를 돌려 블록 트리밍을 시작합니다. 시료의 표면이 거의 노출되면 두께를 5 또는 10 마이크로미터로 제어하는 레버를 설정합니다. 샘플 표면에 도달하면 트리밍을 중지합니다.

얼음 상자와 파라핀 블록이 얼음에 직접 닿지 않도록 충분한 물로 채웁니다. 오래된 마이크로톤 블레이드를 버리고 단면에 새 칼을 삽입합니다. 파라핀 블록을 거즈로 말리고 마이크로톤에 놓습니다.

거친 손 바퀴를 돌려 파라핀을 단면화하기 시작합니다. 그런 다음 젖은 페인트 브러시를 사용하여 파라핀 리본을 섭씨 42도의 수조로 옮겨냅니다. 집게의 곡선을 사용하여 두 파라핀 섹션 사이에 집게를 배치하고 섹션을 부드럽게 밀어 넣습니다.

젖은 페인트 브러시를 사용하여 분리된 부분을 양전하 접착 현미경 슬라이드로 밀어 넣습니다. 먼저, 20분 동안 60°C의 금속 랙에 슬라이드를 배양하여 파라핀을 녹입니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 실온에서 재수화 열차에서 배양을 통해 슬라이드를 분리합니다.

비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 슬라이드를 수돗물에 저장합니다. 그런 다음 125도의 구산완충장에서 슬라이드를 30초 동안, 섭씨 90도에서 10초 동안 배양합니다. 증류수로 5번 헹구기 전에 슬라이드를 식힙니다.

다음으로, 20 분 동안 0.3 %의 과산화수소에서 실온에서 슬라이드를 배양합니다. 그런 다음 슬라이드를 5 분 동안 세 번 씻고 완충액을 부드럽게 교반합니다. 희석 된 1 차 항체와 섭씨 4도로 설정 된 가습 챔버에서 밤새 슬라이드를 배양.

그런 다음 슬라이드를 부드러운 동요로 5분간 세 번 씻습니다. 다음으로, 1시간 동안 실온에서 희석된 바이오티니드 이차 항체의 슬라이드를 배양한다. 부드러운 동요로 버퍼를 세척하여 슬라이드를 5분간 세 번 씻습니다.

그런 다음 어둠 속에서 실온에서 아비딘-바이오타이니드 고추냉이 과로시다제 복합체에서 슬라이드를 1시간 동안 배양합니다. 이전에 설명한 대로 세척을 반복합니다. 그 후, 실온에서 2~5분 동안 DAB 과산화수소 기판 브랜드로 슬라이드를 배양한다.

슬라이드를 수돗물로 헹구고 헤마톡실린 용액에 슬라이드를 찍어 카운터스테인을 처리합니다. 그런 다음 물이 맑아질 때까지 수돗물로 슬라이드를 완전히 헹구십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 슬라이드를 탈수합니다.

마지막으로, 커버는 자일렌 기반 장착 매체로 슬라이드를 슬립하고 실온에서 평평한 표면에서 건조할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜에서 NS는 아가로즈 및 파라핀에 고정되고 내장되어 있습니다. 그리고 그(것)들은 특정 신경교종 biomarkers를 위해 염색됩니다.

크로마틴 구조를 중화시키는 샤페론 단백질인 ATRX의 발현 수준은 낮습니다. Ki67은 세포 증식의 바이오마커로서 신경교종 NS에서 양성이다. 마지막으로, NS는 올리고드엔드로시테 분화를 중재하는 전사 인자 인 OLIG2에도 긍정적이다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 신경구의 균등한 분포를 보장하기 위해 얼음으로 옮겨지기 전에 따뜻한 아가로즈에서 세포를 잘 중단하는 것입니다.