이 프로토콜은 공간 오믹스 기술에 대한 관심 영역의 선택을 안내하는 데 도움이 되며, 이를 통해 조직 또는 세포 집단의 보다 표적화된 특성을 분석할 수 있습니다. 단백질체학 분석에서 ROI 선택을 위한 자동화된 프로토콜은 수동 프로토콜보다 더 강력하고 재현성이 있으며, 전사체학 분석에 50마이크로미터 ROI를 사용하면 특정 세포 집단의 프로파일링이 가능합니다. 형광 시각화 항체를 적용하기 위해 오토염색기를 프로그래밍하는 것으로 시작하십시오.
오토스테이너 소프트웨어에서 홈 버튼을 클릭하고 프로토콜을 선택합니다. 그런 다음 프로토콜 만들기/편집을 클릭하고 절차로 RUO 검색 유니버설을 선택합니다. 첫 번째 시퀀스를 클릭한 다음 Deparaffinazation을 선택한 다음 Depar v2를 선택합니다.
중간 온도의 경우 섭씨 72도를 선택한 다음 전처리를 클릭하고 셀 컨디셔닝 및 CC1 저장소를 선택합니다. 매우 높은 온도의 경우 섭씨 100도를 선택한 다음 CC1 8분을 클릭하고 CC1 64분이 선택될 때까지 계속 클릭합니다. 억제제를 클릭한 다음 DISCOVERY 억제제를 선택하고 배양 시간으로 8분을 선택합니다.
그런 다음 항체를 클릭한 다음 고온 항체 배양을 클릭합니다. 저온의 경우 섭씨 37도를 선택합니다. 항체의 경우 디스펜서 라벨에서 항체 6을 선택합니다.
플러스 배양 시간으로 32분을 선택합니다. 멀티머 HRP를 클릭한 다음 멀티머 HRP 차단기를 선택합니다. 그런 다음 항체 차단의 경우 Gt Ig 차단을 선택합니다.
그리고 배양 시간에 대해 4분을 선택합니다. 다음으로, 다량체 HRP 시약에서 OMap Anti-Rb HRP를 선택하고 배양 시간으로 16분을 선택합니다. 그런 다음 Cy5를 클릭하고 긴 배양 시간에 대해 0 시간, 8 분을 선택하십시오.
이중 서열을 클릭하고 항체 변성을 선택합니다. 그런 다음 항체 변성 CC2-1을 선택하고 매우 높은 온도의 경우 섭씨 100도를 선택합니다. 배양 시간이 8 분인지 확인하십시오.
그런 다음 DS 억제제를 클릭하고 중화를 선택합니다. DS 항체를 클릭하고 매우 낮은 온도의 경우 섭씨 37도를 선택합니다. 그런 다음 항체의 디스펜서 레이블에서 항체 3을 선택합니다.
플러스 배양 시간으로 32분을 선택합니다. DS 멀티머 HRP를 클릭하고 DS 멀티머 HRP 차단기를 선택합니다. 그런 다음 항체 차단에서 Gt Ig 차단을 선택하고 배양 시간으로 4분을 선택합니다.
다음으로, 다량체 HRP 시약에서 OMap 안티-MS HRP를 선택하고 배양 시간으로 16분을 선택합니다. 그런 다음 DS Rhodamine 6G를 클릭하고 긴 배양 시간에 대해 0 시간, 8 분을 선택하십시오. 삼중 염색을 클릭하고 TS 항체 변성을 선택한 다음 항체 변성 CC2-2를 선택하고 극저온의 경우 섭씨 100도를 선택합니다.
배양 시간이 8 분인지 확인하십시오. 그런 다음 TS 억제제를 클릭하고 TS 중화를 선택합니다. TS 항체를 클릭하고 매우 낮은 온도의 경우 섭씨 37도를 선택합니다.
그런 다음 항체의 디스펜서 레이블에서 항체 7을 선택하고 플러스 배양 시간으로 32분을 선택합니다. TS 멀티머 HRP를 클릭하고 TS 멀티머 HRP 차단기를 선택합니다. 그런 다음 항체 차단에서 Gt Ig 차단을 선택하고 배양 시간으로 4분을 선택합니다.
다음으로 다량체 HRP 시약에서 OMap Anti-Rb HRP를 선택하고 배양 시간으로 16분을 선택합니다. 그런 다음 TS FAM을 클릭하고 긴 잠복기에 대해 0시간, 8분을 선택합니다. 저장을 클릭하고 프로토콜에 제목을 추가합니다.
프로토콜 번호를 선택하고 주석을 추가한 다음 Active(활성)를 클릭한 다음 Save(저장)를 클릭합니다. 공급업체에서 조달한 포르말린 고정 파라핀이 내장된 인체 조직 절편을 섭씨 70도로 설정된 오븐에서 20-60분 동안 굽습니다. 슬라이드가 베이킹되는 동안 오토스테이너 소프트웨어에서 라벨 만들기를 클릭하여 라벨을 인쇄합니다.
그런 다음 프로토콜을 클릭하고 프로토콜 번호를 선택한 다음 닫기/인쇄를 클릭합니다. 슬라이드 레이블에 관련 정보를 추가하고 인쇄를 클릭합니다. 오븐에서 슬라이드를 제거하고 실온으로 식히십시오.
이전에 인쇄한 프로토콜 레이블을 해당 슬라이드에 적용합니다. 리필 가능한 항체 디스펜서에 항체 라벨 번호에 따라 항체를 로드합니다. 지정된 희석제에 각 항체를 희석하고 리필 가능한 항체 디스펜서를 프라이밍합니다.
차단, 검출 및 증폭 미리 채워진 시약 디스펜서를 수집하여 기기 시약 트레이에 놓습니다. 슬라이드 서랍에 슬라이드를 로드하고 실행 중을 클릭한 다음 예를 클릭합니다. 오토스테이너 소프트웨어에서 실행 시간을 확인하여 실행 시작을 확인합니다.
다음 날, 슬라이드 서랍 슬롯에서 녹색으로 깜박이는 표시등을 관찰하여 실행 완료를 확인하십시오. 그런 다음 기기에서 슬라이드를 꺼내고 액체 커버 슬립 용액이 완전히 제거될 때까지 1x 반응 버퍼에서 슬라이드를 세게 헹굽니다. 형광단 통합을 가능하게하기 위해 5, 000 나노 몰에서 SYTO 13을 SYTO 64로 대체하십시오.
SYTO 64를 1x TBS로 희석하고 습도 챔버에서 15분 동안 배양합니다. 디스커버리 팸에 FITC를 사용하고 노출을 200밀리초로 설정합니다. 디스커버리 로다민 6G에 Cy3를 사용하고 노출을 200밀리초로 설정합니다.
SYTO 64에 텍사스 레드를 사용하고 노출을 50밀리초로 설정합니다. 초점 채널로 SYTO 64를 지정하고 마지막으로 검색 Cy5에 Cy5를 사용합니다. 노출을 200밀리초로 설정하고 변경 사항을 저장합니다.
포르말린 고정 파라핀 포매 세포 펠릿 섹션을 섭씨 70도로 설정된 오븐에서 20-60분 동안 굽습니다. 공간 프로파일링 플랫폼에서 슬라이드를 스캔하고 50마이크로미터와 300마이크로미터 크기를 선택합니다. 자동화된 시각화 프로토콜은 인접 채널에서 블리드가 없는지 확인하기 위해 하나의 컨트롤을 남겨 두어 개발되었습니다.
공간 단백질체학 분석에 포함된 모든 마커의 로그 2 히트 맵은 검정색의 수동 범사이토케라틴 CD 45 프로토콜과 회색의 자동화된 3-플렉스 프로토콜을 비교하여 0.88의 Spearman R 값을 보여줍니다. 분석에 사용된 31개의 항체 중 23개의 항체는 0.5 이상의 Spearman R 값을 가졌다. 공간 전사체학 분석에 포함된 선택된 표적의 로그 2 히트맵은 검은색의 수동 범사이토케라틴 CD 45 프로토콜과 회색의 3-plex 자동화 프로토콜을 비교한 결과, 이러한 값의 차이를 보여주었습니다.
3-plex 자동 시각화 프로토콜에 대한 시퀀싱 데이터는 범 사이토 케라틴 CD 45 수동 시각화 프로토콜과 비교할 때 더 낮은 값을 나타 냈으며, 이는 0.15의 낮은 Spearman R 값에도 반영됩니다. 또한 3-plex 시각화 자동화 프로토콜을 사용할 때 동적 범위의 손실이 관찰되었습니다. 공간 전사체학 프로토콜에서 작은 ROI의 검출은 50 마이크로미터에서 관심의 원형 영역의 선택에 의해 수행되었고, 상이한 세포주에서 선택된 표적에 대한 300 마이크로미터 직경의 RNA 카운트는 정규화 후 두 관심 영역 크기 간에 비교되었다.
자동화된 시각화 패널을 위한 이 프로토콜은 공간 단백질체학 질문에 답하기 위해 ROI를 정확하게 정의하는 패널을 개발하기 위해 마커를 교환하여 연구원이 조정할 수 있습니다.
