우리는 우리가 형광 분석기를 사용할 수 있도록과 그의 도움을 박사 티에리 Pourcher에게 감사의 말씀을 전합니다. 연구소는 리그 국립 Contre 르 암 (키프의 labellisée)에 의해 자금 지원, 협회는 라 공들인 contre 르 암, 문화원 국립 뒤 암 (INCA)을 부어, 직원은 국립 라 공들인, METOXIA (EU 프로그램 FP7), 센터에게 부어 A. 위치 : Lacassagne, 센터 내셔널 드 라 공들인 Scientifique, 문화원 국립 드 라 상테 외 드 라 공들인 Médicale 니스의 대학 ( <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">http://www.unice.fr/isdbc/</a> ). 우리는 비판적 읽기 및 편집 보정 박사 M 크리스티안 Brahimi를 혼 감사합니다.

글리코겐의 생화학 적정 1. 세포 용해 <ol><li> 100mm 직경 접시 당 0.5 × 106의 농도로 시드 세포. </li><li> 치료 : 세포를 품어 24, 1 % 또는 0.1 % O 2, 94 % 또는 설정 버그 박스 혐기성 워크 스테이션 (Ruskinn 기술 Biotrace 국제적인 Plc, 브리 젠드, UK)에서 낮은 산소 농도 (저산소증)에서 48, 또는 72 시간 94.9 %의 N 2, 5 % CO 2. 병행 (21 % O 2, 5 % CO 2) 정상 산소 상태에서 세포를 배양한다. 실험의 시간 동안 포도당 농도의 변화를 최소화하기 위해 모든 24 시간 (25 mM의 포도당 함유 매체) 매체를 변경합니다. </li><li> 처리 후, 세척 세포는 배양 배지에서 포도당의 흔적을 제거하기 위해 PBS로 2 배. 차가운 PBS의 세포를 다 쳤어요. </li><li> 5 분 동안 1,000 rpm에서 솔루션을 원심 분리기, 상층 액을 버리고 PBS로 한번 펠렛을 씻으십시오. 펠렛을 더 진행하기 전에 -20 ° C에서 얼 수있다.</li><li> 증류수 100 μL에 펠렛을 재현 탁. 글리코겐 분석 키트 (ABCAM)와 함께 제공되는 글리코겐 가수 분해 버퍼 100 μl를 추가합니다. 효소를 불 활성화하기 위해 5 분 동안 95 ° C에서 용해 액을 끓인다. </li><li> 불용성 제품을 제거하는 10 분 동안 13,000 rpm으로 소용돌이 원심 분리기 해물. 뜨는을 유지합니다. </li><li> 샘플 사이의 단백질 함량에 글리코겐 수준을 정상화하기 위해, 단백질의 정량은 Bicinchoninic 산성 분석 (BCA-Interchim)를 사용하여 상청액의 25-35 ㎕를 사용하여 수행 할 수있다. </li></ol> 파쇄물 중 일부는 세포 내부에서 자유롭게 글루코스 농도를 측정하기 위하여 사용될 수있다. 2. 글리코겐의 가수 분해 <ol><li> 가수 분해 효소 믹스 1 μL와 상층 액 (1 단계) 50 μl를 섞는다. 이 혼합물은 글루코 아밀라아제가 포함되어 있습니다. 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 표준 글리코겐 희석하여 검량선을 작성 (2 ㎎ / ㎖)의가수 분해 완충액에서 10 ㎍ / ㎖의 용액으로 키트 upplied. 다음에, 여섯 별도 0으로 튜브, 4, 8, 12, 16 및 10 ㎍ / ㎖의 표준의 20 μL를 준비하여 0으로 글리코겐의 농도를 제공하기 위해 가수 분해 완충액 50 μL의 최종 부피로 각각의 튜브를 조정 0.04 , 0.08, 0.12, 0.16, 0.2 ㎍ / ㎖의. 기준에 가수 분해 효소 믹스 1 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어. </li></ol> 자유 글루코스 농도 값에 의해 주어진 세포주의 배경 글루코스 농도는, 셀의 글리코겐의 수준을 결정하기 위해 전체 글루코스 농도 (글리코겐 분해 + 자유 글루코오스로부터 글루코오스)의 값으로부터 감산되어야한다. 3. 개발 및 형광의 읽기 <ol><li> 각 조건에 대해 무료 포도당 농도와 두 개의 튜브를 측정하기 위해 (튜브 1) 하나의 튜브를 준비 (관 2, 3) 총 포도당 농도 (각 관의 지혜를 측정하는가수 분해 된 글리코겐의 하 다른 볼륨). </li><li> 관 (1) 1 단계의 끝에서 추출 상층 액의 15 μl를 추가합니다. 50 μL의 최종 볼륨에 완료하기 위해 가수 분해 버퍼의 35 μl를 추가합니다. 획득 형광 무료 포도당 농도를 줄 것이다. </li><li> 튜브 2 (2 단계에서 얻은) 가수 분해 된 글리코겐의 X의 μl를 추가합니다. 50 μL의 최종 볼륨을 조정합니다. 시료량 (X μL)는 검량선의 농도를 넘지 않은 형광 값을 얻기 위해서는, 세포 밀도 및 / 또는 세포 종류에 따라 조정되어야한다. </li><li> 관 (3)의 가수 분해 된 글리코겐의 2 개의 X μl를 추가합니다. 50 μL의 최종 볼륨을 조정합니다. </li><li> 각각의 튜브에 대한 개발 버퍼의 48.7 μL, 개발 효소 믹스 1 μL와 (글리코겐 분석 키트에 제공) OxiRed 프로브 0.3 μL를 혼합하여 시료와 표준의 개발 솔루션을 준비합니다. 예를 들어, 2 조건을, 12 관을위한 혼합 준비초 (표준 6, 무료 혈당 2 총 포도당 형광 4). </li><li> 각각의 튜브에이 믹스의 50 μl를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 권장 535 nm의, 587 ㎚의 발광 파장의 여기 파장에서 형광과 여기 및 발광을위한 3 ㎚의 슬릿을 측정한다. </li></ol>

<ol>
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저자는 이익에 대한 갈등을 선언하지 않습니다.

체외에서 글리코겐의 생화학 적정 세포 글리코겐 함량을 정확하게 정량화 할 수 있습니다. 다른 기술 (글리코겐 항체 PAS, 면역, 등.)에 비교해서,이 적정 매우, 특정 민감하고 재현. 그것은 어떠한 방사능하지만 형광 분광기가 필요하지 않기 때문에 더욱, 방법은 편리하다. 그러나,이 방법은 순전히 정량적이고 셀 글리코겐 분포에 대한 정보를 제공하지 않는다. ?...

글리코겐은 여러 종류의 세포의 세포질에 존재하는 글루코스 잔기의 다 분기 폴리머이다. 그것은 세포의 에너지 저장 장치의 주요 형태 중 하나이며 글루코스 대사에 중요한 역할을한다. 대부분의 포유 동물 세포는 빠르게 대사 스트레스를받는 동안 작용과 ATP의 생산을 촉진하기 위해 포도당으로 분해 할 수 있고, 저장 글리코겐을 생성 할 수있다. 간세포함으로써 신체의 포도당 연속적인 공급을 제공하는 혈당치를 조절하기 위해 글리코겐 대량 생산. 대조적으로, 다른 셀 (근육, 적혈구 등) 글리코겐의 농도는 상대적으로 낮다. 그러나, 국부적으로, 이들 양들은 세포가 갑자기 영양소 박탈 환경에 노출되어 단기간에 에너지를 제공하기에 충분하다. 글리코겐 합성과 글리코겐 분해는 모든 조직에서 동일한 단계 (그림 1)을 다음과 같습니다. 첫째, 포도당포도당 수송 체 (과잉)에 의해 세포를 입력하고 빠르게 포스 포 글루코스 -1 - 포스페이트 (G1P)에 포도당 -6 - 인산 (G6P)에서 변환됩니다. G1P이어서 UDP-글루코스로 변성되고, UDP-글루코스 탄소 C1은 glycogenin, 글리코겐의 고정 단백질의 티로신 잔기에 부착된다. 이 분자는 글리코겐 프라이머 고려, 글리코겐 합성 효소를 통해 α (1 → 4) 결합에 의해 터미널 포도당 UDP-글루코오스의 부착에 의해 확장됩니다. 11 이상의 글루코오스 잔기의 선형 사슬이 형성되면 마지막으로, 브랜칭 효소 부근 α (1 → 6) 결합을 통해 체인의 다른 포도당 6 글루코오스 잔기의 최소로 이루어지는 단자 올리고당을 전송한다. 이 과정의 반복은 다시 6.5 포도당과 나선을 형성하는 지점을 포함하는 대규모의 프랙탈 구조를 제공합니다. 글리코겐은 공동 작용에 의해 포도당 역으로 가수 분해 될 수있다분기의 포도당의 마지막 잔여 물과 글리코겐 분자 사이의 결합 글리코 시드 α (1 → 4)을 가수 분해 α (1 → 6) 결합과 글리코겐 포스를 가수 분해 효소를 debranching의. 글리코겐 분해 불리는이 반응은 (ATP 소모를 반영하는) AMP의 농도 증가에 의해 활성화하고, 글루코스 및 ATP 2,3에 의해 억제된다. 전자 현미경으로 글리코겐 분자는 여러 세포 유형, 직경 15 ~ 30 ㎚의 입​​자로서 β 무료 (또는 글리코겐 monoparticles)에서 설명되었다. 그러한 간세포 등의 특정 세포 유형에서, β 입자는 80 nm 내지 200 nm의 (4)의 최대 직경이 될 또한 α 입자라고도 로제트를 형성하도록 복합체로 조립 될 수있다 </SUP&gt;. 이러한 β 입자는 α 입자의 큰 클러스터를 형성하기 위해 결합되는 방식은 아직 완전히 해명되지 않습니다. 몇몇 증거는 β 입자 공유 결합 4.0, 수소 결합, 또는 단백질 - 단백질 상호 작용을 통한 6 의해 결합 될 수 있다는 것을 증명하는 경향이있다. 세포에서 저장된 글리코겐의 양은 많은 변수에 의존한다 : (I) 글리코겐 합성을 개시 셀 glycogenin의 양, 단백질 인산화 / 탈 인산화에 의해 조절 글리코겐 신타 제 및 포스 포 릴라 제의 (II) 활성, (III) 농도 이러한 혈관 시스템에서 포도당의 공급과 세포의 포도당 흡수 등 여러 가지 매개 변수에 의존하는 세포에 포도당. 글리코겐 저장 단단히 에너지 대사를 조절하는 호르몬에 의해, 중간 대사 물질을 생합성 호르몬의 알로 스테 릭 조절에 의해 조절하고, 영양이 감지 신호 전달 경로 7로됩니다. 그것은하는 것이 중요합니다더 나은 몸 전체 및 세포 수준에서 글리코겐 대사의 중요성을 이해하는 생물학적 샘플에서 글리코겐을 정할 수. 우리는 여기에서 글리코겐을위한 체외 분석에서, 정확한 재현하고 편리한 생화학을 설명합니다. 이 기술은 글리코겐의 구체적인 가수 분해 전후 정량화 포도당 형광에 기초한다. 다른 방법은 세포에서의 글리코겐 수준을 추정하기 위해 존재하지만, 대부분은 정량적 않는다. 세포에있는 글리코겐의 정량화 한 제 방법 중 하나는 글리코겐 8,9에 [14 C] - 포도당 결합 측정을 기반으로했다. 방사능 사용 취급이 과정을 더욱 어렵게 만들지 만이 글리코겐으로 그리고 외측 분기와 분자의 코어에서 글루코오스 잔기의 분포를 구별 글루코스 혼입 비율을 제공하는 이점이있다 (또한 필요합니다 추가 β-amylolySIS 및 크로마토 그래피 단계). 또 다른 기술은보다 최근에 개발되었고, 2-NBDG의 혼입에 기반 (2 - {N-[7-nitrobenz-2-옥사 -1,3 - diazol -4 - 일] 아미노} -2 - 데 옥시 글루코오스) 글리코겐 (10)에 2 - 데 옥시 글루코오스 형광 유도체. 측정 된 형광 강도는 제조 글리코겐의 양을 반영하고 형광 판독기로 측정 할 수있다. 셀에서 형광의 분포는 공 초점 현미경에 의해 평가 될 수있다. 다른 nonquantitative 기술 중, 요오드 산 쉬프 염색 (PAS)는 아마도 가장 일반적입니다. 그것은 고정 된 세포, 파라핀 조직 절편 또는 냉동 글리코겐의 검출을 위해 사용될 수있다. 보라색이 조직 학적 기술의 색깔이 아닌 구체적으로 다당류, 당지질, 당 단백질, 셀룰로오스 및 중립 뮤신​​. 이 테스트의 특이도는 특별히 글리코겐 소화 디아스타아제, 고정 세포 또는 조직 섹션의 처리에 의해 증가 될 수있다. 그 후,글리코겐의 수준은 질적 (탄수화물 글리코겐 제외한 고분자를 변경됨) 가수 분해 된 샘플을 가수 분해되지 않은 샘플 (전체 탄수화물 고분자 변경됨)을 비교함으로써 추정 될 수있다. 글리코겐의 생화학 적 분석법 달리 PAS 염색 및 현미경 분석은, 확산 또는 셀의 특정 부분에 집중 될 수있는 셀 글리코겐의 분포를, 관련된 정보를 제공한다. 심지어 다른 조건 사이의 글리코겐 축적 PAS 염색 추정치의 차이하지만 그러나, 11 양적 없습니다. 단일 클론 마우스 항체는 원래 항원 체외 12 세포에서 글리코겐으로 정제 글리코겐과 반응을 보여줘왔다로서 하악 과두 연골을 사용했다. 이러한 항체는 특히 글리코겐 관련 당 사슬 인식로서, PAS 염색보다 더 구체적인 방법으로 면역 조직 화학에 의해 글리코겐의 검출을위한 유용한 도구이다. </p&gt; 전자 현미경은 세포와 글리코겐 저장의 정도의 평가에 글리코겐의 곡물의 시각화를 허용 다른 기술이다. 사실, 글리코겐 β 입자는 전자 조밀 한 과립과 같은 전자 현미경으로 용이하게 인식 할 수있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31966.047</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glycogen Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab65620 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
	 </tr>
		 <tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LS 50B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

biochemical titration of glycogen in vitro

글리코겐은 척추 동물에있는 포도당의 주요 에너지 폴리머 및 중요한 몸 전체의 신진 대사의 역할뿐만 아니라, 세포의 신진 대사를한다. 글리코겐을 감지하는 많은 방법이 이미 존재하지만 몇 가지 양적 있습니다. 우리는 여기에 글루코 아밀라제에 의해 포도당 글리코겐의 분해에 기초하여 특정되는 ABCAM 글리코겐 분석 키트를 사용하는 방법을 설명한다. 포도당이어서 구체적으로 형광을 생성하는 OxiRed 프로브와 반응 생성물로 산화된다. 적정 결과, 정확한 구분하고 세포 추출물 또는 조직 섹션에 달성 될 수있다. 그러나, 다른 기술과 대조적으로, 그 셀의 글리코겐의 분포에 대한 정보를 제공하지 않는다. 이 기술의 예로서, 우리는 정상 산소 상태에서 배양이 세포 선 중국 햄스터 폐 섬유 아세포 CCL39 인간 결장암 LS174, 저산소증 대 (21 % O 2) (1 % O 2) 여기 글리코겐의 적정을 설명한다. 우리는 저산소증이 SIG는 것을 가정NAL 그 세포가 1 살아 남기 위해 합성 및 저장 글리코겐을 준비합니다.

종양 세포에 종양 신호의 산소 (저산소증) 살아남도록 후속 영양분 고갈을 처리하기 위해 에너지를 저장할 필요 저역. 글리코겐은 포유 동물 세포에서 포도당의 주요 에너지 폴리머, 우리는 저산소증에있는 글리코겐 저장의 규칙을 공부했다. 표 1, 2 및 3에 나타낸 바와 같이 세포 용 해물에서의 글리코겐 농도의 계산 및 표준화 형광의 원시 데이터에 대해 수행되어야한다...

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Biochemical Titration of Glycogen In vitro

우리는 여기에서 체외에서 글리코겐의 적정에 대한 정확한 재현하고 편리한 생화학 적 방법을 설명합니다. 이 기술은 ABCAM 글리코겐 분석 키트를 사용하여 형광 적정 포도당과 포도당 글리코겐의 연속적인 가수 분해에 기초한다.

글리코겐의 생화학 적정<em&gt; 체외</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

biochemical-titration-of-glycogen-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

28.2K 조회수.  University of Nice - Sophia Antipolis.  우리는 여기에서 체외에서 글리코겐의 적정에 대한 정확한 재현하고 편리한 생화학 적 방법을 설명합니다. 이 기술은 ABCAM 글리코겐 분석 키트를 사용하여 형광 적정 포도당과 포도당 글리코겐의 연속적인 가수 분해에 기초한다. 

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Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

Immunoperoxidase 분석을 사용하여 인간 Coronaviruses의 적정

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

연구

생물학

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Zebrafish의 두뇌 뇌실 주입

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

바인딩 메커니즘을 결정하기 위해 가변 농도 등온 적정의 열량의 데이터 세트를 수집

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

성인 Zebrafish의 생물 화학 분석을위한 혈액 수집

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

에서 지방 질량의 생화학 및 높은 처리량 미세 평가<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

루시 페라 제 발현 재조합 바이러스의 높은 처리량의 적정

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The fermentable carbon concentration mainly governs how the yeast cells generate ATP; thus, the variation in fermentable carbohydrate levels drives the energetic metabolism of S. cerevisiae. This paper describes a high-throughput method based on exponential yeast growth to estimate the effects of concentration changes and nature of the carbon source on respiratory and fermentative metabolism. The growth of S. cerevisiae is measured in a microplate or shaken conical flask by determining the optical density (OD) at 600 nm. Then, a growth curve is built by plotting OD versus time, which allows identification and selection of the exponential phase, and is fitted with the exponential growth equation to obtain kinetic parameters. Low specific growth rates with higher doubling times generally represent a respiratory growth. Conversely, higher specific growth rates with lower doubling times indicate fermentative growth. Threshold values of doubling time and specific growth rate are estimated using well-known respiratory or fermentative conditions, such as non-fermentable carbon sources or higher concentrations of fermentable sugars. This is obtained for each specific strain. Finally, the calculated kinetic parameters are compared with the threshold values to establish whether the yeast shows fermentative and/or respiratory growth. The advantage of this method is its relative simplicity for understanding the effects of a substance/compound on fermentative or respiratory metabolism. It is important to highlight that growth is an intricate and complex biological process; therefore, preliminary data from this method must be corroborated by the quantification of oxygen consumption and accumulation of fermentation byproducts. Thereby, this technique can be used as a preliminary screening of compounds/substances that may disturb or enhance fermentative or respiratory metabolism.

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Here we present a protocol to estimate the respiratory and fermentative metabolism by fitting the exponential growth of Saccharomyces cerevisiae to the exponential growth equation. Calculation of the kinetic parameters allows for the screening of influences of substances/compounds on fermentation or mitochondrial respiration.

Saccharomyces cerevisiae 호흡과 발효 대사 분석을 배치 문화 지 수 성장 속도 론

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...