그리고 어린이 병원 보스턴에서 심장 전도 기금에 기부,이 작품은 연구 국립 보건원에서 보조금 (HL088206 HL068915)에 의해 지원됩니다.

1 부 : 준비 솔루션 및 절연 perfused 심장 시스템 <ol><li> 이전 [5, 6]를 설명된대로 실험의 아침, 크렙스 - Henseleit 솔루션의 4.0 L가 준비됩니다. </li><li> 11 mMol / L 2,3 - butanedione monoxime (BDM)가 단계 1.1 준비 perfusate에서 decanted 크렙스 - Henseleit 솔루션의 1.0 L에 녹아있다. </li><li> 크렙스 - Henseleit의 추가 150 ML은 단계 1.1 준비 perfusate에서 제거 5 몰 / L DI - 8 - ANEPPS (디메틸 sulfoxide (DMSO)에 용해 10 mMol / L 주식의 희석)로 혼합합니다. </li><li> 5 % CO 2 가스, 이러한 3 솔루션은 물 외피 유리들은 41.0 ° C로 미리 예열 및 95 % 증가 O 2 μm의 필터링 0.2을 사용하여 잠수 버블러 (Radnoti)와 산소 아르 저수지 (Radnoti)으로 전송됩니다. 3 재고 저수지의 솔루션은 MasterFlex ™ L / S 연동 펌프와 낮은 흡수 실리콘 튜브 (콜 - 파머)와 벽 마운트 Langendorff 시스템에 펌핑하고 있습니다. </li><li> 이전 조립, Langendorff 시스템 유리 (Radnoti)는 꼼꼼하게 E - TOXA - CLEAN 시약 (시그마 - 알드리치)으로 세탁과 철저히 0.1 M / L HCL, 100 % 에탄올 및 증류수로 씻어서 있습니다. </li><li> 비 순환 Langendorff 장치가 물 외피 가열 코일과 거품 제거기 마음에서 분리 세 별도의 산소 저수지에서 70mm HG 정압를 제공하기 위해 만들어진 (Radnoti) [7]. 3 독립 재관류 라인은 우리가 정확하게 1.3 단계 1.1에서 준비한 솔루션의 배포를 제어할 수 있도록 2 개의 3 방향 stopcocks의 가슴 위에 수렴. 워터 외피 유리는 MasterFlex PharMed BPT 튜빙 (콜 - 파머)과 직렬로 연결되어 있고 39 ° C 예열이 E100 circulators (Lauda)를 사용하여 증류수와 함께. 것입니다 가열 코일 및 버블 트랩에 압력 머리 저수지를 연결하는 백금 - 치료의 실리콘 튜브 (콜 - 파머)를 통해 열 손실이 37 ° C perfusate 마음에 도달 결과. </li></ol> 2 부 : 추수 쥐 심장 설정 Langendorff 재관류 <ol><li> 2백~2백50그램 루이스 쥐 깊은 전신 마취를 유발하기 위해서, 100 MG / kg 케타민을 10 MG / kg Xylazine은 intraperitoneal 캐비티에 주입합니다. 이 혼합하기 위해, 우리는 explantation 절차 동안 혈액 응고 및 심근 국소 빈혈을 방지하기 위해 500 U / kg 헤파린을 추가합니다. </li><li> 마음과 큰 혈관에 쉽게 접근할 경우, 흉부 앞쪽에 벽이 제거됩니다. 그 후, 주변 조직은 신중하게 해부하고 pericardial 자루가 열립니다. </li><li> 하부 대정 맥의 식별 다음,이 배는 5-0 실크 (Ethicon)와 전체 심장 폐 블록이 explanted이다와 함께 출혈도 잡았입니다. 조직은 즉시 얼음에 50 ML의 비커에 들어있는 얼음처럼 차가운 크렙스 - Henseleit 솔루션에 배치됩니다. </li><li> 오름차순 대동맥은 신속하게 식별 및 주변 조직의 해부합니다. 적절한 규모의 정맥 (하버드 장치)가 너무 멀리 대동맥 루트에 정맥을 삽입하여 관상 동맥 재관류 의무를 방해하지 않도록주의한다, 대동맥에 삽입됩니다. 정맥은 5-0 실크 (Ethicon)로 상승 대동맥을 확보합니다. </li><li> 쥐 심장은 다음 정맥에 공기 방울을 도입하지 않고 Langendorff 장치에 배치됩니다. 역행 관상 동맥 혈관 재관류 지금 단계 1.6에서 설명한 압력 머리에서 따뜻한 산소 크렙스 - Henseleit 솔루션으로 설정됩니다. </li><li> 폐를 포함하여 추가 조직은, 지금은 제거하고 심장 기능의 회복을 허용하고 리듬을 안정화하기 위해 20 분 perfused입니다. 이 시간 동안 매우 얇은 열전대 온도 프로브 (콜 - 파머)은 왼쪽 심실 캐비티에 도입하고 5-0 Prolene 봉합사 (Ethicon)와 장소에서 봉합. 프로브는 심장의 온도를 보장하기 위해 온도 컨트롤러 (Digi - 센스)에 연결된 것은 37 유지 ° 물 순환 펌프의 설정을 조정하여 C. 심장 아펙스 떨어지는 perfusate에서 모션이 유출 용기 거즈 조각을 삽입하여 최소화합니다. </li></ol> 파트 3 : potentiometric 염료와 분산 마음과 electrographic 및 광학 신호를 획득 <ol><li> DI - 8 - ANEPPS (Invitrogen)는 꼭지를 사용하여 형광 염료와 크렙스 - Henseleit 혼합을 포함하는 재관류 라인으로 전환하여 마음에로드됩니다. 또한, 18G 정맥들은 충분히 관상 동맥을 통해 도입 염료와 perfused되지 않기 때문에 천천히 이러한 챔버의 각으로 관리합니다이 염료 용액의 왼쪽 및 / 또는 마우스 오른쪽 아트리움 및 추가 50 ML에 배치됩니다. </li><li> 로딩 절차를 수행하는 동안, 3 ECG 리드 (하버드 장치)는 부드럽게 매핑에 사용되는 광학 직면하지 않는 마음의 표면에 게재됩니다. 전극 N O 1 사후 혀끝의 좌심실 부분, N 좌심방에서 O 2, N에 위치합니다 <su<html> 대동맥 루트 (그림 1) 참조 전극으로 P&gt; O 3. 심방과 심실 electrographic 신호는 이후, 디지털 증폭 및 소프트웨어 (레드셔트 영상) (그림 2)를 사용하여 광 신호를 함께 표시됩니다. 오실로 스코프 (TDS 1002 텍트로닉스 모델)도 실시간으로 표면 ECG S를 시각화하고 적절한 서성 거려을 보장하는 데 사용됩니다. </li><li> ECG 증폭기 (휴고 삭스 Elektronik) 설정 : 하이 패스 필터 : 0.1 Hz에서 저역 통과 필터 : 150 Hz에서 </li><li> CMOS 카메라 (레드셔트 이미징)와 macroscope은 마음의 표면에 초점이고 인수 프레임에 중심 있도록 XYZ 조정을 사용하여 배치됩니다. 카메라와 광학은 공진 주파수를 최소화하기 위해 진동 절연 테이블 (마이너스 K 기술)에 탑재하고 있습니다. 동시에, 동축 서성 거려 전극 (하버드 장치)는, 고립, S48 전기 - 자극 장치 (그라스)와 제어 오른쪽 아트리움에 배치되고 심장이 분당 300 비트 (그림 1)에서 진행됩니다. </li><li> 전기 자극 (그라스) 설정 : 속도 : 초당 5 펄스 지연 : 0.2 MS 소요 시간 : 2 MS 볼트 : 6-12 V 모드 : 반복 펄스 : 싱글 </li><li> 수축에서 모션 아티팩트를 부족 광학 녹음 들어, 마음 electromechanically uncoupled해야합니다. 우리는 다시 11 mMol / L의 BDM을 포함 크렙스 - Henseleit 솔루션 재관류 라인을 전환하여이 작업을 수행. 인수 사이에, 마음 준비의 생존을 유지 수 있도록 완전한 크렙스 - Henseleit와 perfused 있습니다. </li><li> 녹음 매개 변수는 다음과 같은 인수 설정 소프트웨어 (레드셔트 이미징)을 사용하여 설정됩니다 : 구성 : 2,000 Hz에서, 128x128 픽셀 어레이 프레임 간격 : 0.5 MS 카메라 앰프 게인 : 5 배 온 - 칩 이득 : 8 배속 - 12Me - 글쎄요 셔터 : 500 MS 지연 프레임 수 : 4,000 기간 : 2000 MS </li><li> 모든 객실과 장비 조명이 꺼져 있거나 촬영 중에 배경 잡음을 제거하기 위해 차폐된 수 있습니다. LED 불빛이 사진 표백과 염색 독성을 줄이기 위해서만 광학 녹음하는 동안 마음을 조명. 광원의 셔터는 컴퓨터의 D -에 - A 보드 (레드셔트 이미징)의 방법으로 제어판을 통해 전달되는 5 V 펄스로 제어됩니다. </li></ol> 4 부 : 레드셔트 이미징 소프트웨어를 사용하여 수집 정보를 분석 <ol><li> 취득 후, 데이터가 서로 다른 필터 설정을 사용하여 처리됩니다. 우리는 일반적으로 밴드 / 스톱 44.0에서 왼쪽 경계와 98.0의 오른쪽 경계로 설정 필터를, 패스 조절 경우를 제외하고 기본 설정을 사용합니다. 나중에 기록된 정보가 처리되고 영화는 (레드셔트 이미징) 생성됩니다. </li><li> 한 인수의 데이터는 2 초 동안 심장 표면에 16,384 사이트에서 현지 전기 활성화에 해당합니다. 이 소프트웨어는이 지역의 신호가 직접적으로 서로와 심방과 심실 electrographic 음반에 비해 수 있습니다. 데이터는 색상 지방 전기 정품 인증을 매핑하고 심장 표면에 spatiotemporal 전기 활성을 보여주는 애니메이션으로이 정보를 렌더링하여 시각입니다. 이러한 애니메이션을 만들려면, 우리는 소프트웨어를 사용 : <ul><li> temporally 및 / 또는 공간 데이터를 필터링 </li><li> 애니메이션의 시작과 끝 시간을 선택 </li><li> 각 픽셀의 휴식 광 강도에 따라 색상지도 광학 신호 </li><li> 마음의 그림과 함께 나타나는 색상 데이터를 오버레이 </li><li> 애니메이션을 생성 </li></ul></li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 perfused 심장 준비가 녹음 도중에 움직이지 경우, 광 신호는 DI - 8 - ANEPPS의 방출 강도의 변경과 관련된 모든 픽셀에 대해 하나 별개의 절정을 보여줍니다. 해당 영화 (그림 3, 4)는 심장뿐만 아니라 동시에 취득 electrographic 기록 (그림 2)의 epicardial 표면에 걸쳐 전파 여기 웨이브 프론트를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. Langendorff - perfused 심장 준비 사진 오른쪽 아트리움에서 서성 거려 전극의 위치를 묘사하고 ECG는 단계 3.2에서 설명한 연결됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="그림 2" border="0" /> 그림 2. perfused 루이스 쥐 심장에서 대표 광학 신호와 electrographic 녹음. 패널 A는 광학 이미징에 사용되는 epicardial 표면의 이미지를 보여줍니다. 패널 B에서 시간이 지남에 따라 형광 방출에 변경 내용을 증명하기 위해 선택한 픽셀의 위치는 색의 화살표로 표시됩니다. Electrographic 신호는 심방 활성화 및 심실 신호에 해당하는 하늘색 라인을 나타내는 빨간색 라인 패널 C에 표시됩니다. 주시기 바랍니다ve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg &quot;&gt;이 수치의 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

<ol>
	<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li><li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction.">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li><li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution.">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li><li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system.">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li><li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling:+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha.">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li><li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li><li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li><li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts.">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li></ol>

동물 실험은 어린이 병원 보스톤에있는 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

anesthetized 쥐에서 마음의 제거는 심근 국소 빈혈을 피하기 위해 빠르게 수행되어야합니다. 국소 빈혈 또는 불충분 관상 동맥 재관류가 발생하면 심장은 가능성이 arrhythmias을 개발하고 infarcted 될 수 있습니다. 또한 이러한 마음 유익 레코딩 및 후속 분석을 위해 충분하지 형광 방출 표시됩니다. 염료를로드하기 전에, 심근 세포 전기 자극의 안정성에 대한 physiologic 전해질 환경을 설정하고 유지하기...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CardioCMOS-SM128f</td>
<td>Equipment</td>
<td>RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CardioPlex Software</td>
<td>Equipment</td>
<td>RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LUXEON LED Light Source 460-490 nm </td>
<td>Equipment</td>
<td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td>
<td>LXHL-PB02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>730149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic Mirror 505 nm</td>
<td>Equipment</td>
<td>Semrock, Rochester, NY 14624 USA</td>
<td>FF505-SDi01-25x36</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Emission Filter 605 nm Long Pass</td>
<td>Equipment</td>
<td>SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>THT Sideways</td>
<td>Equipment</td>
<td>SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA</td>
<td>25 BM-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Ball Joint Holder</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Small Stimulation Electrode Set</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform</td>
<td>Equipment</td>
<td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td>
<td>25 BM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monopolar ECG Electrode</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Roller Pump SCI 400</td>
<td>Equipment</td>
<td>Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA</td>
<td>401U/D1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Roller Pump MasterFlex Easy Load II</td>
<td>Equipment</td>
<td>Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA</td>
<td>Model 77201-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing Marprene #14</td>
<td>Equipment</td>
<td>Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA</td>
<td>902.0016.016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MasterFlex Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td>
<td>06485-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S48 Square Pulse Stimulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT</td>
<td>Equipment</td>
<td>Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA</td>
<td>Model SIU5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA </td>
<td>120142-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml Heating Coil</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>158822</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compliance Bubble Trap</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>130149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Disconnect Cannula</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>72-1444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 72-2630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermocouple Thermometer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA</td>
<td>WU-91100-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe </td>
<td>Equipment</td>
<td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td>
<td>IT-24P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope Tektronix TDS 1002</td>
<td>Equipment</td>
<td>Tektronix Inc., Beaverton, OR 97005 USA</td>
<td>TDS 1002B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2,3-Butanedione monoxime </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO 63132 USA</td>
<td>B0753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Hospira Inc., Lake Forest, IL 60045 USA</td>
<td>RL-0065</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Lloyd Inc., Iowa 51601 USA</td>
<td>LB15705A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E-TOXA-CLEAN&reg;</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO 63132 USA </td>
<td>E9029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di-8-ANEPPS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 USA</td>
<td>D-3167</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optical mapping of langendorff-perfused rat hearts

전압에 민감한 형광 염료로 심장 표면의 광학 매핑은 실험 모델에서 전기 자극을 조사하기위한 중요한 도구가 될 것을 셀 문화 전체 - 장기 규모 범위<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. 정상적인 심장 리듬 동안이나 arrhythmias의 개시 및 유지 보수 전반에 걸쳐 사용 최첨단 광 이미징 시스템 생성 및 행동 잠재력의 전파는 거의 즉시 시각 수 있습니다<sup&gt; [1]</sup&gt;. 최신 상용 - 가능한 시스템은 매우 높은 spatiotemporal 해상도에서 정보를 제공할 수 있으며 더 많은 기존의 방법으로 부과 electrophysiological 장애물을 극복하기 위해 처음 개발된 맞춤식 장비를 기반으로했다<sup&gt; [1]</sup&gt;. 고해상도 및 고속 상보성 금속 - 산화물 - 반도체 (CMOS) 카메라와 강렬한 밝은, 발광 다이오드 (LED가)뿐만 아니라 전압에 민감한 염료, 광학, 및 필터의 발전은 전기 신호 수집을하기 시작했습니다 현미경 작업에 더 익숙한 아르 심장 혈관 세포 생물학을위한 실용. CMOS 카메라의 최신 세대 샘플 준비의 종류에 따라 16,384 픽셀 배열에서 초당 10,000 프레임을 수집할 수 있지만, 같은 photodiode 배열, 레이저 스캐닝 시스템, 냉각 한 - 설립 형광 수집 기술은 충전 - 결합 소자 (CCD ) 카메라는 여전히 다이나믹 범위에 대하여, 신호 대 잡음 비율 몇 가지 뚜렷한 장점을 가지고 있고, 양자 효율<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. 현재 연구에서는 루이스 랫 마음은 perfused되었습니다<em&gt; 예 생체내</em&gt; 37 정질 perfusate (크렙스 - Henseleit 솔루션) · 수정 Langendorff 기기에 C와 함께. 20 분 안정화 기간 후, 마음이 간헐적으로 이미지를 수집하는 동안 수축 - 관련 운동을 제거하기 위해 11 mMol / L 2,3 - butanedione의 monoxime와 perfused되었습니다. 광학 매핑을 위해, 우리는 빠른 속도로 응답 potentiometric 프로브 DI - 8 - ANEPPS로 마음을 읽어<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 μMol / L)와 짧게는 475 ± 15 나노미터 여기 라이트로 준비를 조명. 조명의 전형적인 이초 기간 동안 심장에서 방출 준비&gt; 605의 NM 라이트는 수평 macroscope에 연결된 고속 CMOS 카메라와 함께 몇 군데했다. 이 예제의 경우, 마음 절연 전기 자극 장치에 연결된 동축 전극과 분당 300 비트에서 진행되었다. 동시 양극성 electrographic 녹음은 즉시 - 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 전압 신호와 함께 인수하고 분석했다. 이러한 방법으로 Langendorff - perfused 쥐 심장의 표면에 작업 잠재력은 시각과 electrographic 신호로 등록하실 수 있습니다.

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Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

이 문서 potentiometric 염료 (DI - 8 - ANEPPS)를 사용 Langendorff - perfused 쥐 심장의 표면에 광학 이미지 조치 가능성이 운동에 높은 시간적 및 공간적 해상도 기법을 설명합니다.

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

optical-mapping-of-langendorff-perfused-rat-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K 조회수.  Children's Hospital Boston and Harvard Medical School. 이 문서 potentiometric 염료 (DI - 8 - ANEPPS)를 사용 Langendorff - perfused 쥐 심장의 표면에 광학 이미지 조치 가능성이 운동에 높은 시간적 및 공간적 해상도 기법을 설명합니다.

비디오: Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

현미경의 올바른 관리 및 청소

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

연구

생물학

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

라이트 현미경의 주요 구성 요소

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

단계 대비 및 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

작은 하트의 세미 - 자동 광학 도면 분석

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

높은 처리량 응용 프로그램에 대한 성인 Zebrafish의 마음의 복구

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.