우리는 mGFP 마우스에 대한 S. 아버하고 비판적으로 신문을 읽고 기술 지원을 제공하는 Zervas 연구실의 구성원에 감사하고 있습니다. A. 브라운은 뇌 과학 카플란 여름 대학원 연구 상을 지원했다. E. 노르망는 뇌 과학 프로그램 대학원 연구 상을 지원했다. 이 연구는 또한 시동 연구 자금 (MZ)에 의해 재정 지원되었다.

Tamoxifen의 준비 및 구내 Gavage 절차 (E8.5) <ul><li> 사전 예열 옥수수 기름에 tamoxifen을 해소하여 tamoxifen의 20 MG / ML 재고 솔루션을 준비합니다. </li><li> 37 솔루션을 품어 ° C nutator과 간헐적으로 소용돌이로 2 시간. </li><li> 4 광 저장 ° C에서 tamoxifen 주식을 보호하고, 1 개월 최대 사용합니다. </li><li> 그리고 유전자 특정 크리어 T의 allele과 기자 allele 모두를 나르는 남자, 운명 매핑 실험 들어, 스위스 웹스터 여성 (타코닉에서 구입한 wildtype)로 구성된 번식 쌍을 설정합니다. mGFP 남성 (엘리서 2009), 데모를 위해, 우리는 Wnt1 - 크리어 T를 사용하고 있습니다. </li><li> 질 플러그의 모양을 위해 매일 아침 스위스 웹스터 여자를 확인합니다. 질 플러그가 0.5 일 이후의 성교로 여겨지고있다 오늘의 아침 (0900)을 지정하고이 시작점을 기준으로 tamoxifen 관리의 날짜를 계산합니다. (이 실험을 위해, 배아 일 8.5이 사용되었습니다). </li><li> tamoxifen 주식 솔루션 (4 MG tamoxifen) 200 μl를 그리는 동물 먹이 바늘 (20G X 1-1/2)로 1 ML의 주사기를 사용합니다. </li><li> 단단히 목의 목덜미를 쥐고하여 시간 임신 스위스 웹스터 여자를 구속하고 다시 머리를 고정하고 복부 측면가 직면되도록 뒤집. </li><li> 직선에 몸을 유지하는 무료 손가락 사이의 꼬리를 잡아. </li><li> 입 구석에 먹이를 바늘을 넣고 부드럽게 입안의 지붕을 따라 바늘을 안내입니다. </li><li> 그것은 몸에 평행이되도​​록 동시에 틸팅 헤드가 다시 똑바로 목을 유지하는 동안 바늘을 회전합니다. </li><li> 위쪽으로, 식도 아래 바늘을 안내입니다. 기관을 입력하지 않도록주의하십시오. 바늘, 동물의 개그 반응 종사하거나, 마우스 투쟁 경우, 즉시 바늘을 제거하고 다시 gavage을 시도에 대한 저항이있다면. </li><li> 먹이를 바늘이 위 속에되면, 위장으로 tamoxifen을 관리하고 해부의 날짜까지 그녀의 홈 케이지에 암컷을 반환합니다. </li></ul> Craniotomy : <ul><li> Intracardially 성인 운명 4% PFA와 마우스를 매핑 perfuse하고 그냥 어깨 위에있는 척추를 절단하여 가위로 머리를 제거합니다. </li><li> 두피를 잘라 스컬을 폭로하기 위해 머리 (꼬리에 주동이의)의 지느러미 정중선을 따라 메스를 실행합니다. </li><li> 메스를 사용하여 두개골의 측면과 함께 후부에서 초과 조직 또는 근육 멀리 다쳤어요. </li><li> 포셉, 찔린 단지 후각 구근에 주동이의 훌륭한 가위의 조언을 수용하기 위해 작은 구멍을 만들 정중선에서 두개골과 함께. </li><li> 이 구멍에 좋은 가위를 삽입하고 후각 구근의 측면 약 길이로 절개가 중간합니다. 이 상처가 비골과 정면 뼈의 교차로에서 두개골을 휴식하고 가위 좋은 액세스를 제공합니다. </li><li> 기본 조직의 손상을 방지하기 위해 멀리 두뇌에서 직각 가위 도움말을 계속해야하는 두개골 (지느러미 정중선)에서 화살 봉합을 따라 잘라. </li><li> 부드럽게 머리를 노출하는 중간 절개 함께 뼈를 집게와 떨어져 껍질 두개골을 파악. 두개골은 작은 조각으로 떨어져 칩 또는 더 큰 섹션에 와해 수 있습니다. 이마, 정수리, interparietal 및 후두 뼈를 모두 제거하는 포셉를 사용하여 계속합니다. </li><li> 양쪽에있는 구면 뼈를 곤란하여 paraflocculi을 (소뇌의 수준에있는 두뇌의 측면 가장자리를 따라 위치) 표시할 수 뼈를 균열. 부드럽게 뼈를 멀리 당기십시오. </li><li> 거꾸로 머리를 턴 (지느러미 쪽 아래)와 두개골 신경을 끊을 수 있고 두개골에서 뇌를 공개 포셉을 사용합니다. </li></ul> 전체 마운트 현미경 : 성인 브레인 <ul><li> 형광 해부 범위를 사용하여 GFP 마킹에 대해 성인용 머리를 평가합니다. </li><li> PBS 및 PictureFrame 또는 기타 적절한 소프트웨어를 사용하여 사진을 포함하는 페트리 접시에 머리를 전송합니다. </li></ul> 전체 마운트 현미경 : E12.5 태아 <ul><li> 형광 해부 범위를 사용하여 GFP 마킹에 대한 전체 마운트 배아를 평가합니다. </li><li> PBS 및 PictureFrame 또는 기타 적절한 소프트웨어를 사용하여 사진을 포함하는 페트리 접시에 전체 장착하여 긍정적인 GFP하는 이들을 전송합니다. </li><li> 각각의 배아에서 꼬리의 작은 조각을 공략하기 집게를 사용하여 PCR 튜브의 각 조각을 배치하고 유전자형 전체 마운트 분석을 통해 본 결과를 확인하기 위해 두 대립 유전자에 대한 PCR을 (엘리서 2009)를 사용하여 조직을. </li></ul> 마이크로 해부와 E12.5 태아의 복부 mesencephalon의 explant 준비 <ul><li> 자궁 체인 및 ID의 절개를 다음전체 마운트 형광, 세포 배양 접시에 얼음처럼 차가운 멸균 PBS로 전송 배아의 운명을 매핑 배아의 entification. </li><li> 좋은 가위를 사용하여 rhombomere 1 꼬리 transversely 절단 배아의 머리 부분을 제거합니다. </li><li> 다음, diencephalon 통해 코로나 잘린 머리의 주동이의 부분을 제거합니다. 이것은 튜브와 같은 구조하는 mesencephalic 소포 양식 지느러미와 복부 조직 사이의 통로를 통해 4 뇌실. 노출됩니다 </li><li> 조심스럽게 가위 도움말 완벽하게 &quot;오픈 도서&quot;준비를 생성, 튜브를 열고, 주동이의에 꼬리 지느러미 정중선을 따라 4 뇌실, 그리고, 싹둑,에 넣습니다. mesencephalon의 두 지느러미 반쪽이 옆으로있는 반면 복부 mesencephalon은 지금, medially 노출됩니다. </li><li> 더 단호하다로 조직하기 위해서는 복부 mesencephalon 밑에 남아있는 이외의 신경 조직을 제거합니다. 필요하다면, explant의 지느러미 &quot;날개&quot;는뿐만 아니라 평면하다 것이라는 등 주동이의와 꼬리 부분에 노치합니다. explant 이제 &quot;등의 mesencephalon의 날개를 상징하는 나비, 그리고 rhombomere 1 꼬리 유사합니다. </li><li> 자세한 외과 분석이나 세포 배양 실험에 대한 복부 mesencephalon를 분리하려면, 조직의 측면 (지느러미 부분)를 제거합니다. </li></ul> 대표 결과 : 이 GIFM 실험에서 Wnt1 - 표현 전지는 영구적이며 heritably E8.5에서 Wnt1 - CreERT으로 tamoxifen을 투여하여 embryogenesis 동안 표시, mGFP의 배아가. 그 후이 표시된 전지는 전지 개발에 걸쳐 신경 구조에 기여하는 방법 Wnt1 파생 결정하기 위해 전체 마운트 형광 및 섹션 immunohistochemistry를 통해 시각입니다. 전체 마운트 형광은 mGFP 기자의 멤브레인 바운드 GFP 구성 요소에 의존하므로 셀룰러 정보뿐만 아니라 Wnt1 - 파생 신경 예측의 overarching 볼 수 있습니다. 예를 들어, 주로 midbrain, 사후 hindbrain 및 척수 (그림 1A)에 E12.5 전시 GFP의 형광에 E8.5, Wnt1 - CreERTmGFP의 배아에서 tamoxifen 관리와 함께. 높은 배율에서 고급의 연결을 전망은 midbrain, 신체 벽, 사지, 그리고 craniofacial 지역 innervating 볼 수 있습니다. 이 발달 단계에서 배아는 반투명이고 내부 GFP 라벨은 쉽게 분별이다. 그러나, 두뇌 개발과 같은, 성숙한 조직의 밀도는 내부 뇌 구조에서 냄새가 나는데 GFP의 형광을 가린다. 따라서, E8.5에서 tamoxifen 관리와 함께, 오직 사소한 GFP 라벨이 전체 마운트 형광 (그림 1C, 삽입된 페이지)로 성인의 우수한 colliculi에서 관찰됩니다. 또한, 일부 axonal 전망은 (표시되지) hindbrain의 복부 표면에 따라 자, 이제 볼 수 있습니다. 대조적으로, tamoxifen이 E9.5에 투여되었을 때, 실질적인 GFP 라벨은 전체 열등한 colliculi (그림 1B, 삽입된 페이지)에 걸쳐 발생합니다. 전체 마운트 형광이 증가 나타낼 수 Wnt1 - 표현 E9.5에서 세포 등의 midbrain의 표면 지역에 더 크게 기여하거나 E8.5에서 Wnt1 표현 세포보다이 지역 내에서 많은 프로세스를 확장합니다. 에 관계없이 전체 마운트 형광이 차이는 개발하는 동안 Wnt1 표현의 동적 특성을 반영하고 GIFM가 성숙한 성인으로 배아에서 뚜렷한 세포 인구를 수행하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. Wnt1 - CreERT에서 immunohistochemistry, 운명 매핑 조직 섹션, mGFP 동물은 세포 수준에서 분석하고 있습니다. GFP 및 β - galactosidase (β - 여자)에 대한 항체가 신경 세포 구조와 유형에 Wnt1 혈통의 벌금 규모 세포 기여를 결정하는 조직을 특정 생체 다양한와 함께 사용됩니다. E12.5에서 E8.5에서 tamoxifen의 관리 및 조직 분석, 이중 긍정적인 세포 (GFP +와 β - 여자 +)가 복부 midbrain (그림 1B)를 통해 자, 이제 계획과 midbrain과 hindbrain 전반에 걸쳐 관찰하고 있습니다. 성인 두뇌에서 E8.5에 표시된 Wnt1 - 일족이 뛰어난 및 하부 colliculi뿐만 아니라 복부 tegmental 지역 substantia 니그라 (그림 1D)의 dopaminergic 세포 집단의 주변에 (보고 등 많은 midbrain 구조에 상승을 제공합니다 또한 2004) Zervas. 대조적으로, E9.5에 표시된 Wnt1 - 일족이 열등 colliculi뿐 아니라 dopaminergic 세포 집단 (그림 1 층)의 주변 뉴런에 상승을 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 Wnt1 - 운명 매핑을위한 대표 결과. : Wnt1 - CreERT에서 전체를 탑재하고 immunocytochemistry 결과의 예, mGFP 배아 및 E8.5 (AD)에 (로 표시) 매핑 성인 두뇌의 운명그리고 E9.5 (EF). A. Wnt 1 크리어, E12.5 전시 GFP의 주로 midbrain에서 형광 (MB), 후부 hindbrain (HB)과 척수 (SP)에서 mGFP의 배아. B. 표시 전지는 시각이 1 μm의 두께 광학과 (40x 목표, Z - 시리즈 취득)에 같이 immunohistochemistry하여 세포 수준에서 분석했다. 원자력 β - galactosidase (nβ - 여자) 항체 라벨 (적색)과 GFP 항체 라벨 (녹색)은 복부 midbrain에 표시된 운명을 매핑 세포를 나타냅니다. 여기 recombined 세포 때문에 조건부 mGFP 기자의 성격 (nβ - 걀 + / GFP +) 이중 긍정적인 수 있습니다. C. 전체 - 마운트 개화 현미경은 성인의 우수한 colliculi (SC) (삽입된 페이지)에서 희미한 GFP의 형광을 나타낸다. 낮은 배율로 성인 섹션에 E8.5에 표시된 Wnt1의 혈통 평가 (5 배) 현미경은 Wnt1의 혈통은 (SC) 우수와 열등 (IC)를 포함 colliculi midbrain 구조로 상승 준 보여줍니다 (C). nβ - 여자 + 세포와 풍부한 GFP + axonal 신경 얼기와 dopaminergic 뉴런의 주변에있는 복부 midbrain에서 가져온 D. 40x, 1mm 광학 섹션을 참조하십시오. 쉽게 전체 마운트 형광 (삽입된 페이지)의 midbrain의 열등한 colliculus에서 관찰됩니다 상당한 GFP 라벨에 E9.5 결과에서 E. 표시. 낮은 배율 (배) 현미경 (E)로 볼 수로 성인 섹션 (β - 여자 +, 빨강)에 E9.5에 표시된 Wnt1의 혈통은 하부 colliculus (지느러미 - 후부 midbrain)에 집중되어 있습니다. nβ - 여자 + 세포와 풍부한 GFP + axonal 신경 얼기와 dopaminergic 뉴런의 주변에있는 복부 midbrain에서 가져온 F. 40x, 1mm 광학 섹션을 참조하십시오. Wnt1의 혈통은 복부 midbrain에 기여에 지속하면서 E8.5 대 E9.5에 표시된 Wnt1 - 파생 뉴런은 점차적으로, 지느러미 midbrain에 공헌에서 제한됩니다.

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	<li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system.">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li><li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1.">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li></ol>

모든 저자는 동등하게이 작품에 기여하고 알파벳순으로 나열됩니다. 각 개인의 공헌은 그의 혹은 비디오 문서에 그녀의 참여에 의해 분명합니다.

우리가 보여준 그 GIFM 시스템은 셀룰러 프로세스의 다양한 질문에 다양한 답변을하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 서로 다른 Cre 호텔 드라이버 엔지니어링 생쥐는 모든 세포 유형, 조직 또는 관심있는 유전자 혈통을 대상으로 사용할 수 있습니다. tamoxifen 어떤 배아 또는 출생 후의 시점에 시행 될 수 있기 때문에 또한, 재조합은 어떤 관련이 발달 단계에 타겟팅할 수 있습니다. 이 시스템의 ...

a practical approach to genetic inducible fate mapping: a visual guide to mark and track cells in vivo

운명의지도 progenitors가 개발 및 성인 조직에서 특정 구조 및 세포 유형에 기여하는 방법을 결정하는 생체내의 세포를 표시 및 추적에 의해 생성됩니다. 이런 개념에서 사전에 내가 유전자 혈통에 따라 운명이지도를 만드는, F는 유전자 발현, 세포의 운명, 그리고 생체내 세포의 동작을 연결, M apping (GIFM)를 먹은 nducible G enetic입니다. GIFM 이용 X - 크리어 라인 여기서 X는 수정된 박테리오 파지 단백질, Cre 호텔 recombinase (크리어 T)의 공간적 표현을 수여 유전자 규제 요소 유전자 또는 집합입니다. 크리어 T는 크리어 T를 렌더링으로 수정된 전자 strogen R eceptor의 리간드 바인딩 도메인을 포함하고 약물 tamoxifen의 부재에있는 세포질에서 분리된. loxP 사이트 둘러싸인 DNA 시퀀스 사이의 핵 및 mediates의 재조합에 translocates tamoxifen 출시 크리어 T의 결합. loxP 그런 GFP로 기자의 유전자를 앞에 카세트를 중지 어귀 사이 GIFM에서 재조합 일반적으로 발생합니다. 마우스는 어느 지역 또는 셀 타입 특정 크리어 및 조건부 기자 allele을 포함, 훈련하고 있습니다. 기자의 중지 카세트의 리포터 유전자의 추가 전송을 방지하기 때문에 치료 생쥐가 표시가 없습니다. 우리는 크리어 T 릴리스와 기자의 중지 카세트를 제거 핵에 후속 translocation의 시간적 제어를 제공 초과 - 임신 여성에 경구 gavage으로 tamoxifen을 관리할 수 있습니다. 재조합 다음, 기자의 allele은 constitutively하고 heritably 표시됩니다. 사건의이 시리즈는 자신의 유전자의 역사가 기록됩니다 indelibly 그러한 세포를 표시합니다. recombined 기자는 따라서, 한번에, 처음 크리어의 T를 운전하는 데 사용되는 유전자 발현의 uncoupled는 높은 충실도 유전자 혈통의 추적 역할을합니다. 우리는 성인 세포 유형과 조직에 유전 lineages의 정상적인 발전과 확인할 기여를 공부하기 위해 마우스 GIFM를 적용합니다. 우리는 또한 더 나은 인간의 유전 질환의 돌출 기능을 모방 복잡한 phenotypes을 이해하는 돌연변이 유전자 배경에 세포를 따라 GIFM 사용합니다. 실험 방법을 통해이 동영상이 문서에서는 가이드 연구자를 성공적으로 GIFM을 적용합니다. 우리는 잘 특징 Wnt1 - 크리어 T를 사용하는 방법을 보여줍니다; E12.5에서 절개 및 epifluorescence stereomicroscopy에 의해 분석하여 다음 구두 gavage 통해 배아 일 (E) 8.5에서 tamoxifen을 투여하여 mGFP 마우스. 우리는 또한 explant 준비 또는 외과 분석을위한 운명 매핑된 도메인을 마이크로 해부하다 및 전체 마운트 형광 이미징을위한 성인 운명 매핑 두뇌를 해부하다하는 방법을 보여줍니다. 총체적으로,이 절차는 연구자가 발달 생물학과 질병 모델에서 중요한 질문을 해결하실 수 있습니다.

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A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

유전자 Inducible의 운명 매핑 (GIFM) 마크와 훌륭한 공간과 시간적 제어 트랙 세포<em&gt; 생체내에</em&gt; 그리고 특정 유전 혈통의 세포가 개발하고 성인 조직에 기여하는 방법을 elucidates. epifluorescent 및 explant 분석을위한 운명지도 E12.5 마우스 배아에 필요한 기술은 여기에 보여주었다.

유전자 Inducible의 운명 매핑에 대한 실용적인 접근법 : 셀을 선택하고 추적하는 비주얼 가이드 VIVO에서</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

16.7K 조회수.  Brown University. 유전자 Inducible의 운명 매핑 (GIFM) 마크와 훌륭한 공간과 시간적 제어 트랙 세포 생체내에 그리고 특정 유전 혈통의 세포가 개발하고 성인 조직에 기여하는 방법을 elucidates. epifluorescent 및 explant 분석을위한 운명지도 E12.5 마우스 배아에 필요한 기술은 여기에 보여주었다.

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Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

Drosophila에서 Visual과 강한 중재 플라이트 컨트롤을 맡은 이후로 자기 테더 시스템

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Embryogenesis 동안 중복 기능을 테스트하기 위해 역방향 유전자 접근

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

기형 종의 형성에 의해 인간 배아 줄기 세포의 운명 매핑

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

비전문가를위한 계통 발생에 대한 실용 가이드

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

COSMIC와 세포의 약물-DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (작은 분자의 가교는 염색질을 분리)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...