이 모델을 통해 중요한 전임상 단계의 연구자는 새로운 제형의 항균 효능을보다 정확하게 결정할 수 있으며 연구자는 약물 설계 및 제형을보다 잘 제어 할 수 있습니다. 이 모델은 대표적인 상처 환경에서 신속하게 재현 가능한 결과를 가능하게 합니다. 그것은 목적으로 사육 된 동물의 필요성을 줄이고 상처 감염에 대한 국소 항균제를 클리닉으로 더 빨리 번역 할 수 있도록합니다.
주요 과제는 오염과 손재주입니다. 엄격한 무균 기술과 조직 처리에 대한 인내심이 필수적이며,이 방법의 성공을 위해서는 정확하고 목적이있는 플랩 제거가 필요합니다. 집게를 섭씨 200도에서 1 시간 동안 건열 살균에 노출시켜 소독부터 시작하십시오.
사용하기 전에 모든 유리 제품을 섭씨 121도에서 15분 동안 오토클레이브하십시오. 약 100ml의 200PPM 이산화염소 용액을 샘플 영역에 부어 램프의 이마 부분을 소독합니다. 전기 클리퍼를 사용하여 이마 부분을 면도 한 다음 200PPM 이산화 염소 용액 200ml로 세척하십시오.
에탄올과 파란색 롤을 사용하여 해당 부위를 닦고 샘플 부위를 제모 크림으로 덮습니다. 35분 후, 스크래핑 도구를 사용하여 제모 크림을 부드럽게 긁어내고 샘플 영역을 평가합니다. 상당한 양의 머리카락이 남아 있으면 제모 과정을 반복하십시오.
깨끗한 샘플 영역을 200ml의 이산화 염소 용액으로 헹구고 에탄올과 파란색 롤로 헹굽니다. 멸균 된 8mm 생검 펀치를 사용하여 준비된 영역에서 8mm 피부 샘플을 잘라냅니다. 그런 다음 멸균 집게와 15 번 블레이드 메스를 사용하여 샘플을 제거하여 모든 피부 지방이 제거되도록합니다.
멸균 PBS로 채워진 멸균 0.5리터 병에 샘플을 넣습니다. 그런 다음 50 PPM 이산화 염소 용액 50 밀리리터로 채워진 멸균 된 200 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브를 두 번 뒤집어 30 분 동안 멸균하십시오.
샘플을 40 밀리리터의 멸균 PBS로 채워진 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. PBS 세척 후, 각각의 피부 샘플을 24-웰 플레이트의 별개의 웰에 둔다. 공기-액체 계면에서 샘플을 유지하면서 웰에 350 마이크로 리터의 예열 된 배지를 추가합니다.
24 웰 플레이트를 가스 투과성 플레이트 씰로 밀봉 한 후 배양 할 플레이트를 5 % 이산화탄소 및 섭씨 37 도의 가습 조직 인큐베이터에 24 시간 동안 놓습니다. 배양 후, 배양 배지를 제거하고 샘플을 500 마이크로리터의 멸균 PBS로 헹구었다. 무항생제 배지로 처리하여 샘플에서 잔류 항생제를 제거합니다.이산화탄소 및 섭씨 37도에서 24시간 동안 처리합니다.
무항생제 배지에서 탁도 또는 곰팡이 감염이 발생하면 샘플을 폐기하십시오. 다음으로, 10 밀리리터의 멸균 트립신 간장 국물로 50 밀리리터 튜브를 준비하십시오. 그런 다음 S.aureus의 신선한 한천 플레이트에서 여러 개의 황색 포도상 구균 콜로니를 국물로 옮기고 튜브를 섭씨 37도 및 150RPM에서 18 시간 동안 배양합니다.
튜브를 4, 000 G에서 3분 동안 원심분리한 후, 상청액을 제거하고 세포 펠렛을 멸균 PBS 10ml에 재현탁시켰다. 멸균 PBS를 사용하여 접종물을 600나노미터 파장에서 0.6 광학 밀도로 조정하기 전에 PBS 세척을 두 번 반복합니다. 수동 실행 가능한 플레이트 수로 접종 부하를 확인합니다.
피부 샘플을 감염시키려면 400마이크로리터의 사전 예열된 무항생제 배지가 있는 새로운 24웰 플레이트를 준비하고 멸균 집게를 사용하여 24웰 삽입물을 추가합니다. 피부 샘플에서 배지를 제거합니다. 500 마이크로리터의 멸균 PBS로 세척하고 세척물을 제거한다.
멸균 집게를 사용하여 샘플을 우물 바닥에 부드럽게 고정하십시오. 4mm 펀치 생검을 사용하여 피부 샘플을 1-2mm의 거친 깊이로 뚫고 중앙 상처 플랩을 만듭니다. 그런 다음 15 번 블레이드 메스와 멸균 치아 Allis 조직 집게를 사용하여 상처 플랩의 최상층을 제거합니다.
모든 샘플이 감겨지면 멸균 포셉을 사용하여 24 웰 인서트로 옮깁니다. 15 마이크로리터의 박테리아 접종물을 상처 층에 피펫팅한 후 가습된 조직 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 더 긴 배양 기간의 경우, 배지를 제거하고, 24 시간마다 신선한 배지로 교체하고, 동일한 조건에서 플레이트를 배양하십시오.
박테리아 부하를 결정하려면 우물 바닥에서 매체를 제거하십시오. 그리고 멸균 집게를 사용하여 각 샘플을 1 밀리리터의 멸균 PBS로 채워진 별도의 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 미세한 팁 균질화기로 샘플 표면을 균질화하여 상처 침대 표면에서 박테리아를 분리합니다.
상처 베드가 균질화기의 팁과 직접 접촉하는지 확인하십시오. 모든 샘플이 처리되면, 20 마이크로리터의 균질액을 180 마이크로리터의 멸균 PBS를 함유하는 96-웰 플레이트의 상응하는 웰로 옮기기 전에 각 샘플을 와동시킨다. 각 샘플 균질액을 1회 10 내지 7음수로 연속 희석하고, 10 마이크로리터의 피펫으로 희석된 균질액을 트립틱 대두 한천 플레이트 상에 삼중으로 삼중으로 희석한다.
트립신 대두 한천 플레이트를 섭씨 37도에서 배양하고, 18시간 후에 콜로니의 수를 세어 각 샘플에 대한 콜로니 형성 단위 또는 CFU를 결정한다. 다양한 기간 동안 다른 치료법을 사용하여 적절한 피부 살균 요법을 확인했습니다. 조직 무결성을 조직학에 의해 모니터링하고, 치료 직후에 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.
이산화염소로 30분간 처리하는 것이 가장 효과적인 치료법이었으며, 조직 무결성을 유지하면서 피부 조직을 재현 가능한 살균했습니다. 상처 침대의 흰색 필름은 감염 48 시간 후 조직에서 분명했습니다. 스크래치 모델은 24시간 후 더 높은 평균 CFU 수를 나타내었지만 플랩 제거 상처 기술은 보다 일관된 결과를 생성했습니다.
48 시간 후, 접종 물에 비해 상처 조직에서 약 100 배 더 많은 박테리아 CFU가 회수되어 성공적인 감염을 나타냅니다. 감염된 조직의 그람 염색 된 조직학 섹션은 감염되지 않은 조직의 섹션에는없는 상처 층에 S.aureus 세포의 존재를 나타냅니다. 이 절차에 따라 면역 조직 화학을 수행하여 조직 반응을 연구하고, 박테리아 위치를 시각화하기 위해 변형 된 그람 염색 및 항균 노출 후 생존 가능한 플레이트 수를 수행하여 항균 효능을 테스트 할 수 있습니다.
새로운 항균제를 개발하는 연구원들에게 이 모델은 납 최적화에 대한 더 큰 제어를 제공하고, 비싸고 엄격하게 규제되는 동물 실험에 대한 의존도를 줄이며, 항균제를 클리닉으로 신속하게 번역할 수 있도록 합니다.
