이러한 모델은 세포 및 사이토카인 운동 및 상처 폐쇄를 포함한 상처 치유 반응의 다양한 측면을 평가하기 위해 구현될 수 있다. PVA 스폰지 모델은 페노티픽 및 기능 분석을 위해 수백만 개의 상처 백혈구를 회수할 수 있으며, 꼬리 피부 절제 모델은 느린 치유 상처의 쉬운 시각화를 가능하게합니다. PVA 스폰지 및 절제테일 테일 상처 모델은 당뇨병이나 폐렴과 같은 혼수 상태와 함께 상처 치유에 미치는 영향을 이해할 수 있습니다.
메레디스 크레인으로 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 조수 인 빌 헨리가 될 것입니다. 실험을 시작하기 전에 가위를 사용하여 PVA 스폰지 시트를 8-8-4 밀리미터 조각으로 자른다. PBS에서 스폰지를 살균하기 전에 10 분 동안 비커에 멸균 PBS로 스폰지 조각을 다시 수분처리하십시오.
스폰지가 식으면 PBS에 잠긴 스폰지를 섭씨 4도에 보관하십시오. 시술 당일, 실험동물 1인당 6개의 스폰지를 멸균 라미나르 플로우 후드에 멸균 배양 접시에 넣고, 8주에서 12주 된 남성, C57-Black/6 마우스에 발가락 꼬집어에 대한 반응이 부족한지 확인한다. 보조 용 클리퍼를 사용하여 도섬과 멸균 거즈를 따라 머리카락을 제거하여 면도 부위에 포비도네 요오드 용액을 두 번 적용한 다음 70% 에탄올 한 번 적용합니다.
그런 다음 도우미는 가열 패드 위에 배치 멸균 수술 커튼에 마우스를 전송해야합니다. 멸균 장갑을 착용하고, 집게를 사용하여 등색 피부를 기본 조직에서 끌어당기고 멸균 수술 가위를 사용하여 등주 중간선을 따라 약 2센티미터 절개를 꼬리의 베이스로 만듭니다. 멸균 집게로 절개를 열고, 멸균, 곡선, 무딘 팁 수술 가위를 사용하여 도면에 표시된 위치 중 하나에서 도섬을 따라 피하 포켓을 형성한다.
가위를 삽입하면 팁을 두 번 열고 닫아 삽입 된 스폰지를 잡을 수있을만큼 큰 포켓을 형성하십시오. 포켓이 생성되면 멸균 수술 가위를 사용하여 문화 접시에 PVA 스폰지 1 개를 부드럽게 짜서 과도한 PBS를 제거하십시오. 다음으로, 스폰지를 한 쪽 구석으로 들어 올리고 가위가 들고 있는 모서리로 이어지는 스폰지를 피하 주머니에 넣습니다.
여섯 개의 스폰지가 모두 입증된 대로 배치되면 멸균 포셉을 사용하여 절개 된 등불 피부를 함께 꼬집어 두 개의 스테인레스 스틸 상처 클립으로 절개를 닫습니다. PVA 스폰지 유체 절연의 경우 이식 후 1~14일 후에 수술용 스테이플을 제거하고 치아 집게로 절개를 엽니다. 가위를 사용하여 등주 미드라인을 따라 절개를 확장하고 집게를 사용하여 피하 포켓에서 하나의 스폰지를 추출합니다.
스폰지를 얼음 위에 16 밀리리터 배양 튜브에 중첩된 5 밀리리터 주사기의 배럴에 넣고 필요에 따라 스폰지 표면에 부착된 결합 조직을 분리합니다. 모든 스폰지가 추출되고 입증된 대로 옮겨지면 배양 튜브를 원심분리하여 상처 액을 수집합니다. PVA 스폰지에서 세포를 분리하려면 스폰지를 수집 한 후 HBSS 수집 배지 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 원추형 튜브에 넣습니다.
모든 스폰지를 수집하면 스폰지 서스펜션을 80 밀리리터 블렌더 백에 넣고 패들 블렌더의 해치에서 가방을 걸아 패들이 스폰지와 매체를 공격할 수 있도록 합니다. 패들 블렌더를 60초 동안 높이로 실행하도록 설정하고 시작합니다. 블렌더가 멈춘 후 가방에 스폰지를 짜서 배지를 완전히 방출하고 파이펫을 사용하여 믹서기 가방에서 15 밀리리터 튜브로 배지를 다시 옮겨넣습니다.
패들 블렌더의 설정을 조정하여 30초 동안 높이 로 실행하고 블렌더 백에 5 밀리리터를 추가합니다. 수집된 매체의 튜브를 원심분리하기 전에 위닝 과정을 두 번 더 반복합니다. 세포와 적혈구의 적색 펠릿은 원문 관의 바닥에 표시되어야합니다.
증류수 900마이크로리터를 세포와 3~5초 동안 혼합한 후 10x PBS의 100마이크로리터와 1x PBS의 4밀리리터로 리시스를 중화시합니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 다운스트림 분석을 위한 적절한 배지에서 백혈구 펠릿을 재보중단한다. 꼬리 피부 상처를 만들기 위해, 마취, 8- 12 주 된, 남성, C57-블랙 / 6 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 수술 부위에 두 번 포비도네 요오드 용액을 적용하기 위해 멸균 거즈를 사용하여 70 %의 에탄올을 적용합니다.
영구 마커와 미리 만들어진 템플릿을 사용하여 꼬리의 등대 표면에 10 x 3 밀리미터 섹션을 추적하고 꼬리 베이스에서 10 밀리미터를 추적하고 마우스를 멸균 수술 커튼에 놓습니다. 멸균 수술 장갑을 착용하고 멸균 메스 블레이드를 사용하여 상처 부위의 오른쪽, 아래 및 왼쪽 가장자리를 따라 전체 두께 절개를 합니다. 멸균 포셉을 사용하여 절제된 피부를 꼬리에서 떼어내고 멸균 수술 가위를 사용하여 상처 부위의 상단 가장자리를 잘라냅니다.
멸균 거즈를 사용하여 상처에 압력을 가하여 출혈을 멈추고 상처 침대에 스프레이 장벽 필름을 발라주세요. 이어서, 일정한 시간 간격으로 고정된 거리에서 상처를 촬영하고, 평면 분석을 통해 사진을 분석하여 상처 부위 측정을 결정한다. PVA 스폰지 이식 수술은 부상 후 하루 플라즈마에서 IL-6의 유도에 의해 입증된 바와 같이 전신 염증 반응을 생성한다.
PVA 스폰지 상처에서 복구 할 수있는 세포의 수는 시간이 지남에 따라 증가, 호중구와 함께, 단세포, 및 스폰지 내에서 인구에 침투 기본 세포를 포함하는 대식세포. 호중구는 Ly6G 양성, 시글-F-음성 세포로 식별됩니다. 시그렉-F 양성 세포는 주로 호산구입니다.
Ly6G 음성에 게이팅, Siglec-F-음성 셀F4/80 양성 단세포 및 대식세포의 식별을 허용. F4/80 양성 세포는 Ly6C 고염증단세포 및 Ly6C 저단세포 유래 대식세포를 구별하기 위해 Ly6C 발현에 의해 더욱 분화될 수 있다. 흥분 꼬리 피부 모델은 조밀한 털이 부족한 단단한 피부에서 상처 폐쇄를 연구하는 등지 피부 펀치 생검 방법에 대한 대안을 제공합니다.
상처 폐쇄는 시간이 지남에 따라 상처 침대의 면적을 측정하여 정량화 될 수 있습니다. 꼬리 피부 상처는 또한 H와 E와 마슨의 삼색 염색을 통해 조직학 분석에 의해 단면에서 관찰될 수 있습니다. 이러한 이미지에서, 절제된 피부의 측면 여백은 꼬리의 등쪽 표면에 있는 화살촉에 의해 표시됩니다.
꾸준한 상태 상처 치유를 이해하기 위해, 치료 화합물 또는 내정간섭은 또한 PVA 스폰지로 직접 주입을 통해 또는 꼬리 상처 침대에 납품을 통해 시험될 수 있습니다.
