이 기사에서는 임상 번역 파이프라인의 일환으로 중요한 효능 데이터를 제공할 수 있는 최적화된 ex vivo 인간 피부 상처 프로토콜을 제시합니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 인간의 피부에서 상처 수리의 높은 처리량 정확한 평가를 허용한다는 것입니다. 절차를 보여주는 엘리자베스 로버츠, 박사 후 연구원, 알렉산드리아 키드, 우리의 실험실에서 연구 조수.
상처에 대한 피부 조직 샘플을 준비하려면 피부 진미 면을 90mm 페트리 접시에 내려 놓고 멸균 가위를 사용하여 지방 조직을 제거하십시오. 모든 지방이 제거되면, 지방 조직에서 잔류 혈액을 제거하기 위해 간헐적으로 흔들리는 실온에서 10 분 동안 항생제로 보충 된 HBSS의 25 밀리리터에 피부를 배치하십시오. 10분 후, DPBS의 25밀리리터로 피부를 헹구는 다.
10 분 후, 항생제없이 HBSS 헹구기를 반복한 다음 DPBS의 25 밀리리터에서 최종 헹구기를 수행합니다. 그런 다음 멸균 나일론 필터 멤브레인을 흡수 패드 스택에 놓고 90mm 페트리 접시에 멸균 거즈에 피부의 진피 면을 건조하여 잔류 DPBS를 제거합니다. 말린 피부 진피 쪽을 깨끗한 90mm 페트리 접시 뚜껑에 놓고 잔류 DPBS를 제거하고 신선한 멸균 거즈로 표피를 건조시킵니다.
상처를 만들려면 피부를 단단히 잡고 부드럽게 비틀면서 피부에 2 밀리미터 생검 펀치를 누릅니다. 구부러진 이빨 이티슈 집게를 사용하여 약 2밀리미터 직경의 상처의 각 면을 선택하고 상처 아래 휘어진 홍채 가위를 후크합니다. 중앙 2 밀리미터 상처 주위생검에 6 밀리미터 생검 펀치를 사용하여 중앙에 부분 두께 2 밀리미터 상처가있는 6 밀리미터 해출을 만듭니다.
그런 다음 상처 절제 표피를 나일론 필터 멤브레인 스택에 올려 놓고 1 ~7 일 잠복식을 섭씨 32 ~ 37도 및 이산화탄소 5 %에서 배치하십시오. 형광 염색의 경우, 1.5 밀리리터 마이크로센트심분리기 튜브에 튜브 당 500 마이크로리터의 피부 고정제를 함유하고 4도에서 하룻밤 동안 이물질을 배양합니다. 다음 날, 고정을 염색 세척 버퍼의 1 밀리리터로 교체하십시오.
세척 후 각 샘플을 약 150 마이크로리터의 블로킹 버퍼로 덮고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 차단 버퍼를 제거한 후, 튜브 당 버퍼를 차단하는 데 희석된 1차 항체의 150마이크로리터를 추가하고 상처가 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 배양한다. 다음 날 아침, 0.2%의 아지드 나트륨을 함유한 염색 세척 버퍼 500마이크로리터로 샘플을 헹구고 일반 세척 버퍼에 3개의 헹구는 것으로 나타났다.
세척 후, 실온에서 1시간 배양을 위해 각 웰에 염색 세척 버퍼에 희석된 적절한 플로레스션-컨쥬게이징된 이차 항체 150마이크로리터를 첨가한다. 인큐베이션이 끝나면 세척당 염색 세척 버퍼 500마이크로리터에서 30분 동안 30분간 세척을 한 후 실온에서 150마이크로리터의 DAPI를 10분 동안 재염색합니다. 마지막으로, 세척당 500 마이크로리터의 세척 버퍼로 30 분 동안 2 번 세척하십시오.
각성 이미징의 경우 60mm 페트리 접시를 공초점 현미경의 이미징 플랫폼에 놓고 약 1밀리리터 층의 DPBS층을 접시에 추가합니다. 집게를 사용하여 상처 내간을 접시에 옮겨보도록 합니다. 실험에 적합한 이미징 소프트웨어를 설정한 후, 이미징 평면의 중앙에 상처를 배치하고 상처 생검의 이미지를 획득한다.
무선 현미경 이미징을 수행하여 비용 효율적인 방식으로 고품질 이미지를 얻으려면 휴대폰이나 랩톱을 무선 디지털 현미경에 연결합니다. 이별 상처쪽을 실험실 조직에 올려 놓고 샘플에서 잔류 세척 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 현미경의 시야 의 중심에 각을 배치하고 연결된 카메라를 사용하여 이미지를 수집합니다.
면역페로시다제 및 면역형광은 전체 마운트 조직 염색에 사용될 수 있다. 또한, 라이브/데드 염색은 신선한 조직상에서 수행될 수 있으며, 사전 또는 사후 고정을 이미지화할 수 있다. 상처의 전체 마운트 염색은 재현 가능한 방식으로 상처 폐쇄 율을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
본 대표적인 분석에서, 건강한 피부 상처 폐쇄는 당뇨병 피부 상처가 7일 분석 기간 내에 완전히 닫히지 못하는 동안 4~5일 후에 관찰되었다. K14 발현은 건강한 피부 상처에서 2일째 에 정점을 찍은 후 표피 분화가 증가하면서 급격히 감소했습니다. 이 재상피화 및 후속 표피 분화는 당뇨병 피부 상처에서 지연되었다.
초기 표피 장벽의 재구성은 분화된 표피 층 내의 K14 항체 침투를 배제한다. 재상피화 과정 초기에 K14 양성 기저층 각질세포는 내부 상처 에지에 가까운 표피보다 일찍 외부 상처 가장자리에 가까운 표피가 형성되는 개방된 상처 위로 안쪽으로 이동한다. 나중에 수리 단계에서 표피가 외부와 안쪽으로 구별됨에 따라 K14 염색이 손실됩니다.
전체 마운트 염색은 또한 피부에서 다른 상처 관련 마커의 발현 및 국소화뿐만 아니라 치유의 다른 단계에서 상처 부위에 관심있는 면역 세포의 존재를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 재현 가능한 절제적 상처를 생성하는 것은 처음에는 어려울 수 있습니다. 우리는 잉여 피부를 사용하여 상처 절차를 연습하는 것이 좋습니다.
