염기 절제 복구 효소가 염색질의 맥락에서 DNA 병변을 제거하는 방법에 대한 구조적 정보는 부족합니다. 이것은 인간 질병의 병인과 관련된 메커니즘에 대한 우리의 이해에 상당한 격차를 구성합니다. 당사 프로토콜의 주요 장점은 표준 실험실 장비를 사용하여 샘플 준비를 최적화했다는 것입니다.
이를 통해 현장의 다른 생화학자들은 기술적으로 실현 가능한 Cryo-EM 연구로 생화학 연구를 보완할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 개척자 전사 인자를 포함한 다른 인자가 뉴클레오솜에 어떻게 관여하는지 조사하는 데 추가로 사용될 수 있습니다. 이것은 구조적 정보도 제한적인 영역입니다.
동결 조건으로 이동하기 전에 시료 전처리를 최적화하는 것이 프로젝트를 진행하는 데 핵심적인 역할을 했으며, 이는 기질 설계, 결합 및 가교 조건에서 표준 생화학적 분석을 통해 가장 잘 수행됩니다. 시작하려면 특정 복합체에 대한 최적의 완충액을 사용하여 15분 동안 얼음 위에서 NCP와 DNA 복구 인자를 배양합니다. 그런 다음 글루타르알데히드를 최종 농도 0.005%로 첨가한 후 잘 혼합한 후 실온에서 13분간 배양한다.
1몰 Tris-CL로 pH 7.5의 최종 농도 20밀리몰 Tris-CL로 급냉합니다. 이어서, 약 50 마이크로리터로 농축하고, 탈염 컬럼을 사용하여 완충액을 동결 완충액으로 교환한다. 다음으로, 광학 밀도 280 및 260 나노미터에서 흡광도를 결정하고, 광학 밀도 280 나노미터를 기준으로 밀리리터당 1.3 내지 3 밀리그램에 도달하기 위해 필요한 경우 추가로 농축한다.
투석 버튼을 준비한 후 멤브레인이 아래를 향하도록 하여 폴리에틸렌 글리콜 베드 위에 샘플이 들어 있는 버튼을 놓습니다. 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제를 수행하기 위해, 크기 배제 컬럼을 60 밀리리터의 증류수로 세척하고 평형화시킨 다음, 분당 0.4 밀리리터의 속도로 밤새 80 밀리리터의 동결 완충액을 세척하였다. 그런 다음 즉시 피크 분획을 분석하고 히스톤의 주입 단백질 MBP-PolBeta-APE1을 포함하는 분획을 농축합니다.
엘리자베스 비베렛(Elizabeth Viverette)은 여기 NIH의 Cryo-EM 코어에서 학사 후 과정을 밟고 있는 연수생입니다. 플런지 냉동고를 켜고 가습기에 증류수 50ml를 채운 후 챔버 온도를 섭씨 22도, 습도를 98%로 설정한 다음 에탄 컵과 액체 질소 컵을 각각의 공간 홀더에 넣습니다. 그런 다음 에탄 컵을 에탄 뚜껑 디스펜서로 덮고 그 위에 액체 질소를 조심스럽게 붓고 질소 컵에 액체 질소를 채웁니다.
액체 질소 수준이 안정화되어 100%에 도달하고 온도가 섭씨 영하 180도에 도달하면 에탄 밸브를 조심스럽게 열고 투명한 뚜껑에 거품이 생길 때까지 에탄 컵을 채웁니다. 그런 다음 에탄 디스펜서를 제거합니다. 두 개의 여과지를 블로팅 장치에 놓고 금속 링으로 고정합니다.
설정으로 이동하여 원고에 설명된 대로 블로팅 매개변수를 설정한 다음 A-Plunge를 선택하고 확인을 클릭합니다. 메인 화면에서 Load Posps를 클릭하고 탄소 도포 면이 왼쪽을 향하도록 그리드를 로드합니다. 집게를 보정하고 Z축을 조정하여 단단한 얼룩을 보장합니다. Lower Chamber를 클릭하고 3 마이크로 리터의 복합체를 적용하십시오.
그런 다음 Blot A-Plunge를 클릭하면 그리드가 회전하여 전면에서 블롯이 되고 플런지 프리즈됩니다. 이송 후 그리드를 액체 질소 챔버의 그리드 상자에 보관하십시오. 4개의 그리드가 모두 고정되어 그리드 상자에 배치되면 모든 그리드가 뚜껑으로 덮인 중립 위치로 뚜껑을 돌리고 나사를 조입니다.
현미경에 샘플을 로드하기 전에 유리화된 그리드를 링에 놓고 얼음 오염을 방지하기 위해 습도가 조절되는 방에서 액체 질소 아래 C-클립을 사용하여 고정합니다. 현미경을 로드할 때 그리드를 12슬롯 카세트에 삽입합니다. 카세트를 nanocab 캡슐에 넣고 오토로더에 장착합니다.
그런 다음 그리드를 카세트에서 현미경으로 옮깁니다.tage. 스테이지를 10도 흔들어 스테이지를 유센트릭 높이로 조정하고 이미지에서 최소한의 평면 이동이 관찰될 때까지 Z 높이를 동시에 움직입니다. 유센트릭 높이에 도달하면 각 몽타주를 62배 배율로 촬영한 그리드의 3x3 몽타주 이미지를 촬영하여 이미징을 시작하여 아틀라스를 얻습니다.
다양한 크기의 정사각형 3개를 선택하고 유센트릭 높이를 취한 후 210x 배율로 이미지를 만듭니다. 정사각형이 이미지화되면 정사각형 내의 가장자리, 중앙 및 그 사이에서 각각 하나의 구멍을 선택합니다. 그런 다음 각 구멍을 2, 600x 배율로 이미지화합니다.
36, 000x 배율 및 7.1 초 노출 시간, 60 프레임, 1.18 픽셀 크기 및 3 마이크로 미터 디 포커스로 구멍 중앙에서 고배율 이미지를 가져옵니다. 상영의 대표 이미지를 참조하십시오. 안정적인 복합체를 형성하기 위한 MBP-PolBeta-APE1에 대한 NCP의 비율을 결정하기 위해 전기영동 이동성 이동 분석을 수행했으며, 이는 MBP-PolBeta-APE1의 5배 몰 초과로 NCP의 단일 이동 밴드를 보여주었습니다.
더 작은 부피에서 NCP-PolBeta-APE1 복합체의 조립은 샘플이 과도하게 가교되어 식별 가능한 개별 복합체가 없는 응집체를 생성한다는 것을 입증했습니다. 그러나 NCP를 10배 희석하면 응집이 크게 감소하고 입자 안정성이 향상되었습니다. 분취 겔과 크기 배제 방법을 결합할 수 있는데, 여기서 분취 겔은 상당한 양의 고분자량 응집체를 포함할 때 NCP의 품질을 개선한 다음 크기 배제를 통해 복합체를 정제합니다.
결과는 두 방법 모두 독립적으로 사용하여 안정적인 복합체를 생성할 수 있음을 보여줍니다. 또한 두 그리드에서 수집된 데이터는 약 3.2옹스트롬 해상도에서 거의 동일한 2차원 클래스와 3차원 지도를 보여줍니다. DNA 복구 인자에 대한 NCP의 최적 비율을 먼저 결정해야 하며, 그 다음 복합체와 글루타르알데히드의 가교결합은 동결에 필요한 농도보다 최소 10배 더 희석하여 수행되어야 합니다.
복합체의 Cryo-EM 3D 지도를 얻은 후 DNA 복구 인자를 찾는 방법을 결정하고 이러한 상호 작용에 중요한 영역을 식별하기 위해 추가 구조적 개선이 필요합니다.
