이 프로토콜은 쥐 관상 동맥의 국소화, 분리 및 근육 고리 고정을 자세히 소개합니다. 다양한 심혈관 질환의 메커니즘, 탐구 및 치료를위한 새로운 방법을 제공합니다. 이 시스템은 시험관내 동맥 장력의 동적 변화를 안정적으로 기록하고, 직경이 60 마이크로미터에서 10 밀리미터까지 판독하는데 적합하다.
초보자는 먼저 각 혈관의 해부학 적 위치를 정확하게 이해하고 흉부 동맥 및 장간막 동맥과 같은 약간 더 큰 혈관으로 시작할 수 있다고 제안합니다. 심장을 해리시키고 제거한 후, 의료용 플라스틱 포셉으로 가볍게 짜서 모든 심장 챔버에서 잔류 혈액을 배출하는 것으로 시작하십시오. 전처리 된 심장을 섭씨 4도에서 95 %의 산소와 5 %의 이산화탄소 포화 생리 소금 용액을 함유 한 페트리 접시에 신속하게 넣고 pH 값이 7.40입니다.
관상 동맥의 해부학 적 위치를 정확하게 식별하려면 개략도에 따라 광학 현미경으로 격리 된 심장의 자세를 조정하십시오. 외과 용 가위와 핀셋으로 폐동맥의 뿌리에서 심실 간 중격을 따라 좌심실 및 우심실 충치를 자릅니다. 왼쪽 및 오른쪽 관상 동맥을 심근 조직에서 분리하려면 광학 해부학 현미경으로 우심실을 해부하여 오른쪽 관상 동맥 가지를 철저히 노출시킵니다.
그런 다음 심장 조직을 시계 방향으로 45도 회전시켜 왼쪽 관상 동맥의 위치를 확인하십시오. 주변의 끈적 끈적한 심근 조직을 제거한 후 맥박 왼쪽 및 오른쪽 관상 동맥을 명시 적으로 식별하십시오. 중간에 있는 관상동맥을 즉시 분리하고 섭씨 네 도에서 생리적 소금 용액에 완전히 담그십시오.
해부학 적 가위로 분리 된 동맥을 수직으로 절단하여 약 두 밀리미터의 동맥 고리를 획득하여 다른 자극하에 혈관 긴장을 기록하십시오. 두 센티미터의 스테인레스 스틸 와이어 두 개를 준비하고 95 % 산소와 5 % 이산화탄소로 포화 된 섭씨 네 도의 생리 소금 용액에 미리 담그십시오. 두 와이어를 광학 해부학 현미경으로 혈관의 방향과 함께 동맥 링을 통해 평행하게 통과시키고 혈관 공동의 양쪽 끝에 노출 된 동일한 길이의 와이어를 사용하십시오.
95 % 산소와 5 % 이산화탄소로 버블 링 생리 학적 소금 용액으로 채워진 와이어 현미경 사진의 욕조에서 강철 와이어 앞뒤와 함께 동맥 링을 고정하십시오. 수평 나사 손잡이를 적절한 앞뒤 간격으로 돌려 두 와이어가 수평이 되고 동맥 링이 자연스럽게 이완되도록 합니다. 온도 조절 장치에 DMT 배쓰를 설치한 후, 데이터 수집 소프트웨어를 열어 대응하는 경로 신호가 기록되었는지 확인하십시오.
매개 변수를 설정합니다. 혈관의 직경을 따라 합리적인 장력을 가함으로써 동맥 고리의 최적의 초기 장력을 달성하십시오. 이 시점에서 표시된 혈관 긴장 값을 0으로 설정합니다.
그 후, 욕조의 나선형 축을 회전시켜 동맥 링에 세 밀리 뉴턴 펄스 자극을 적용하십시오. LCD 패널을 클릭하여 0밀리뉴턴으로 설정하고 한 시간 동안 유지합니다. 섭씨 37도 pH 7.40에서 산소 포화 생리적 염 용액 완충액에서 한 시간 동안 인큐베이션한 후, 와이어 현미경 사진의 장력 대조군 패널 상에서 다시 장력 값을 제로밀리뉴턴으로 설정하였다.
와이어 근그래프 기술로 관상동맥 고리의 수축 활성을 수행하고 각각 10분 동안 60밀리몰의 칼륨 이온 용액으로 자극하여 세 가지 개별 조작으로 검증한다. 각 자극 후, 혈관 톤이 초기 상태로 돌아올 때까지 산소 포화 생리 학적 소금 용액으로 욕조를 플러시하십시오. 0.3 마이크로 몰 U46619를 욕조에 넣고 10 분 동안 관찰하십시오.
하나의 마이크로 몰 아피제닌을 추가하고 혈관 효과를 관찰하십시오. 팽창이 고원에 도달하면 다음 농도를 추가하십시오. 혈관 효과를 관찰하기 위해 60 밀리몰 칼륨 사전 수축 용액에 하나의 마이크로 몰 아피제닌을 첨가하십시오.
팽창이 고원에 도달하면 다음 농도를 추가하십시오. 휴식 혈관 고리에 28 밀리몰 칼륨 이온을 첨가하십시오. 수축이 고원에 도달하면 다음 농도를 추가하십시오.
휴지 혈관 고리에 0.01 마이크로몰 U46619를 첨가한다. 수축이 고원에 도달하면 다음 농도를 추가하십시오. 초기 세 밀리 뉴턴 장력이 동맥 고리에 적용된 후, 그 장력은 60 밀리몰 칼륨 이온 농도를 세 번 병렬로 적용함으로써 두 밀리 뉴턴 이상을 초과했습니다.
따라서 위의 절차는 우수한 생리 활성을 갖는 분리 된 관상 동맥 고리를 초래했다. 누적 칼륨 이온 농도 또는 U46619를 DMT620M의 욕조에 첨가하여, 농도 의존적인 시험관내 혈관 톤의 증가를 초래하였다. 칼륨 이온 또는 U46619의 다음 농도는 혈관 수축 효과가 고원에 도달했을 때 첨가되었다.
칼륨 이온 및 U46619에 의해 수축된 단리된 관상동맥 고리의 경우, 시험 약물인 아피게닌은 놀랍게도 농도 의존적 방식으로 혈관확장을 일으켰다. 심장은 폐동맥의 뿌리에서 심실 중격을 따라 해부되어 두 밀리미터 길이의 관상 동맥 근육 고리를 노출시키고 분리합니다. 이 절차에 따라, 우리는 망막 미세 혈관, 신장 기능, 신장 동맥 및 중간 대뇌 동맥에서 혈관 긴장을 기록 할 수 있습니다.
60 마이크로 미터에서 10 밀리미터까지 역동적 인 영역.
