표면 플라즈몬 공명 분광법은 중간 처리량 방식으로 단백질 리간드의 측정을 위해 확립되었습니다. 동일한 분자의 결합 부위 변이체에 대한 상이한 친화도가 제시되는데, 즉 바이러스에 대한 고매너 올리고당의 철 결합에 대한 것이다. SPR은 표면 고정 수용체의 실시간 고분자 결합을 연구하는 무표지 기술입니다.
멀티사이트 상호작용은 SPR을 사용하는 연구에서 억제제를 탐색하기 위한 약물 개발 또는 항체 특성화의 크기와 무관하게 경쟁적 결합에 의해 동역학 분석에서 인식된다. 운동 상수와 친화도는 센서 응답에서 직접 계산됩니다. 시작하려면 LB-한천 플레이트에 100 마이크로 리터의 용액을 옮기고 멸균 세포 스프레더를 사용하여 부드럽게 펴 바릅니다.
프라이머 농도를 일정하게 유지하면서 5 - 50 나노그램 범위의 다중 농도의 이중 가닥 DNA 주형을 사용하여 일련의 샘플 반응을 시작합니다. 그런 다음 광유 오버레이 아래에 DpnI 제한 효소를 추가하고 즉시 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 부모 슈퍼코일 이중 가닥 DNA를 소화합니다. XL1-Blue 초적격 세포를 해동하려면 세포를 사전 냉각된 작고 둥근 바닥 튜브에 분취합니다.
다음으로, 각 대조군 및 샘플 반응에서 DpnI 처리된 단일 가닥 DNA 1마이크로리터를 상보적인 가닥을 합성하는 초적격 세포의 분리된 분취량으로 옮깁니다. 형질전환 반응을 조심스럽게 소용돌이쳐 혼합한 후, 반응물을 얼음 위에서 30분 동안 배양한다. 섭씨 42도에서 45초 동안 변환 반응에 열 펄스를 적용한 다음 반응을 2분 동안 얼음에 놓습니다.
그런 다음 0.5 밀리리터의 NZY + Broth를 넣고 섭씨 37도에서 225-250 RPM으로 1 시간 동안 흔들면서 변형 반응을 배양합니다. 그 후, 이전에 시연된 대로 LB Ampicillin Agar 플레이트에 각 변형 반응의 정확한 부피를 플레이트합니다. 종자 배양의 경우, 형질전환된 플레이트로부터 단일 콜로니가 있는 소량의 암피실린 함유 LB 배지를 접종합니다.
상기 하룻밤 배양액을 이용하여 발현배양액에 염화마그네슘 10밀리몰, 황산마그네슘 10밀리몰, 포도당 20밀리몰 등의 첨가제를 접종하여 종자배양액을 100씩 희석하였다. 다음으로, 세포를 섭씨 20도까지 냉각시키기 전에 섭씨 37도에서 0.4 내지 0.6 사이의 흡수제 600 나노미터로 격렬하게 진탕하면서 세포를 성장시키고 1 밀리몰 IPTG로 유도하고 밤새 성장시킨다. 그 후 섭씨 4도에서 15분 동안 4, 000 g에서 원심분리하여 세포를 수확하고 상층액을 버린다.
세포 펠렛을 포스페이트 완충 식염수 완충액에 재현탁시킨 후, 최근 섭씨 4도에서 15분 동안 4, 000 g으로 피난시켰다. 그런 다음 피펫으로 상청액을 버립니다. 다음으로, 남은 펠릿을 10 밀리리터의 용해 완충액에 재현탁시키고 현탁액을 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양한다.
그런 다음 섭씨 4도에서 15 분 동안 4, 000g에서 원심 분리하여 가용성 및 불용성 분획을 분리합니다. 또한 14 밀리리터 튜브에 HIS-Select Ni2 + Affinity Gel을 사용하여 태그가 부착 된 재조합 발현 시아 노 비린 -N을 각각 20 밀리몰 이미 다졸 및 250 밀리몰 이미다 졸이 함유 된 완충 용액에 결합하고 재현탁시킵니다. 이 단계 사이에 최소 30 분 동안 일괄 배양하십시오.
250 밀리몰 이미다졸을 함유하는 용리 완충액을 첨가하여 단백질을 용리시킨다. 단백질 용액을 10 킬로 달톤 컷오프 필터로 원심 분리 튜브로 옮기고 섭씨 4, 500g 및 4도에서 10 분 동안 원심 분리하여 농축시킵니다. SPR 실행 버퍼를 1에서 10의 희석 계수에 추가하고 4, 500g 및 섭씨 4도에서 10 분 동안 초기 부피에 4 회 원심 분리합니다.
그 후, 23, 474 달톤의 크기를 나타내는 주 단백질 CVN2L0에 대해 계산된 소멸 계수를 기반으로 NanoDrop UV-Visible 분광광도계를 사용하여 280나노미터에서 단백질 농도를 결정합니다. 듀얼 채널 SPR 시스템의 경우 HBSCP plus를 실행 버퍼로, pH 1.5-1.6의 10 밀리몰 글리신 염산을 재생 버퍼로 사용하고 기기 탈기 장치, 자동 시료 주입기 및 펌프를 켭니다. 그런 다음 전체 시스템을 이중 증류수로 1 시간 동안 씻으십시오.
그런 다음 침지 오일을 검출기에 떨어뜨리고 얇은 금 필름으로 코팅된 유리 센서 칩을 장착합니다. 그리고 윗면에는 카르복시메틸 덱스트란 하이드로겔로 3포트 유동 셀 아래의 검출기에 직접 작용화됩니다. 그런 다음 핸들링을 아래로 당겨 설정을 수정합니다.
단백질성 리간드를 센서 칩에 고정하려면 메뉴 표시줄에서 양식을 클릭하여 실행 테이블을 열고 통합 SPP 자동 링크 소프트웨어에서 테이블 편집기를 실행합니다. 그런 다음 사용 가능한 실행 테이블 목록에서 기본 고정화를 선택하고 클릭하고 컴퓨터 화면에서 실험 절차의 단계를 따릅니다. 그런 다음 양식 섹션에서 샘플 세트 편집기를 클릭하여 추가 분석을 위해 자동 샘플러에 배치된 두 랙에 대한 시약 목록을 작성합니다.
메뉴 막대에서 도구로 Autosampler Direct Control을 클릭하여 랙을 앞뒤로 가져오고 작동 온도로 섭씨 4도를 선택합니다. 도구를 클릭하여 이중 증류수를 주입하고 직접 제어하는 펌프를 시작하십시오. 그리고 SPR 기기 직접 제어를 클릭하여 데이터를 기록합니다.
그리고 매번 새로 나타나는 창에서 시작하십시오. 300 마이크로리터 바이알에 커플링 시약을 추가한 후 자동 시료 주입기 랙에 넣고 실행을 클릭하여 실행 테이블을 시작합니다. 간단한 단백질 - 단백질 상호 작용을 위해, 분당 25, 000 마이크로 리터로 펌프를 다시 채운 후 30 초 동안 기준선 조정을 수행하십시오.
활성화된 칩 표면을 1몰 에탄올아민 염산염, pH 8.5로 켄칭하기 전에 1.5분 동안 이중 증류수로 후속 기준선 조정을 허용합니다. 그런 다음 HBS-EP+Click on Form을 사용하여 액체 샘플러에서 탈기 장치로 튜브를 전환하고 아래로 스크롤한 다음 이 작동 모드를 클릭하여 후처리로 변경합니다. 그런 다음 추가를 클릭하여 각 플로우 셀에 대해 데이터 플랫폼에서 시간이 지남에 따라 생성된 바인딩 곡선을 선택하고 오버레이를 스크러버 파일로 내보냅니다.
그런 다음 파일을 클릭하여 파일 저장 옵션을 열고 왼쪽 및 오른쪽 곡선을 정렬하고 리간드 채널의 신호에서 두 번째 기준 채널의 신호를 빼서 응답 곡선을 얻습니다. CVN2L0 및 분산 V2 및 V5의 단일 주입은 먼저 자동 샘플러 및 실행 테이블 편집기를 사용하여 결합 용량을 추정하기 위해 헤마글루티닌 결합 센서 칩에 대한 결합을 테스트했습니다. 반복 주입은 시간이 지남에 따라 시스템의 나노몰 및 마이크로몰 범위의 다양한 농도에서 자동화되어 칩 표면의 포화 또는 평형 결합이 달성되지 않았음을 입증했습니다.
농도 대 반응은 260 마이크로몰의 해리 속도 상수를 갖는 약한 친화도를 갖는 RBD S1 서브유닛 상의 보존될 수 있는 탄수화물의 특이적 표적화를 가정하고, RBD에 대한 CVN 야생형 결합에 대해 플롯팅하였다. DM에 대한 CVN2L0-V4 결합에 대한 동일한 친화도 플롯은 작은 글리코실화된 펩타이드에 대한 고친화도 결합을 방해하고 반응 최대값보다 높은 반응을 산출하는 이황화물 결합의 대체로 인해 더 이상 분석할 수 없게 됩니다. SARS-CoV-2에서 RBD에 대한 CVN 야생형 결합은 각각 18.6 마이크로 몰 및 260 마이크로 몰의 해리 분노 상수로 S 단백질 및 RBD에 대한 결합을 보여줍니다.
분석물 농도에 대한 SPR 응답은 CVN 야생형 및 E41A 결합에 대한 높은 응답 단위 및 일반적인 SPR 센서그램을 초래합니다. 그러나, 돌연변이체는 희석될 때 불안정하다. SPR 바이오센싱은 정제된 단백질과 그 변이체를 리간드에 대한 고친화도 및 저친화도 결합을 해결합니다.
우리의 경우, 센서 칩 표면의 광학 판독 및 이중 채널 흐름 시스템을 이용하는 당 단백질. 효소 면역 흡착 분석은 단백질 에피토프를 인식하는 대체 면역학적 방법이지만 복잡한 매트릭스에서 펩타이드 및 소분자의 농도에 대한 데이터도 제공합니다. SPR 결합 분석에 의한 재조합 발현 단백질 테스트에는 전산 단백질 측면에 의한 단백질 안정성의 검증 및 예측에 유용한 확인 변화의 바이오센싱이 통합되었습니다.
