전임상 심장 위험 평가를 위해 인간 iPSC 유래 심근 세포의 구조적 및 수축성 변화를 평가하기위한 하이브리드 세포 분석 시스템

이 방법은 신약 후보를 임상 단계로 안전하게 전환하기 위해 실제 인간 기반 데이터를 사용하여 전임상 심장 안전성 및 독성 관련 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다양한 체외 및 생체 내 기술 세트를 사용하는 대신이 하이브리드 시스템의 주요 장점은 인간 iPC 유래 심근 세포, 전기 생리 학적 및 생존력 매개 변수의 동시 평가와 생리 학적 조건 하에서의 수축 특성 분석입니다. 이 방법은 심근 세포의 전기 생리학적, 구조적 및 수축적 변화와 69 개의 웰을 동시에 테스트 할 수있는 더 높은 처리량 시스템을 다루기 때문에 약물 발견에 적용 할 수 있습니다.

플레이트 코팅을 시작하려면 수축성 모듈에서 측정할 때까지 추가로 제공된 멤브레인 가드로 수축 플레이트의 바닥을 덮은 상태로 두십시오. 심근 세포를 파종하기 위해 멸균 원심 분리 튜브에 2.75 밀리리터의 EHS 젤 사용 준비 용액과 8.25 밀리리터의 DPBS를 칼슘 및 마그네슘과 함께 옮겨 희석 된 EHS 겔 코팅 용액을 준비하십시오. 그런 다음 용액을 섞는다.

수축판에서 멤브레인 가드를 제거합니다. 준비된 코팅 용액을 실험실 자동화 로봇의 멸균 시약 저장소로 옮깁니다. 프로그램을 사용하여 실험실 자동화 로봇으로 100 마이크로 리터를 추가하고 웰 당 100 마이크로 리터의 코팅 용액을 추가하십시오.

그런 다음 뚜껑을 96웰 플레이트에 다시 놓고 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 세포를 해동하고 계수한 후 셀 제조업체 지침에 따라 권장 도금 매체에서 셀을 조정하면 전체 96웰 플레이트에 시딩하기 위해 11밀리리터당 10에서 6번째 셀을 11배 곱합니다. 프로그램을 사용하여 100 마이크로 리터를 제거하여 실험실 자동화 로봇으로 웰에서 EHS 젤 용액을 제거합니다.

다음으로, 11ml의 세포 현탁액을 실험실 자동화 로봇에 놓인 멸균 시약 저장소로 옮기고 웰당 100마이크로리터의 현탁액으로 세포를 시드합니다. 이 프로그램을 사용하여 세포는 100 마이크로 리터를 추가합니다. 세포 파종 직후 유연한 96웰 플레이트를 섭씨 37도, 5%이산화탄소의 습도 조절 인큐베이터로 옮기고 세포를 밤새 안정시킵니다.

22 밀리리터의 심근 세포 유지 배지를 50 밀리리터 원심 분리 튜브에서 섭씨 37도까지 각 플레이트에 첨가합니다. 플레이트를 파종한 후 18-24시간 후에 새 배지를 멸균 시약 저장소로 옮기고 실험실 자동화 로봇 옆에 둡니다. 그런 다음 프로그램으로 배지 제거를 수행하고 100 마이크로 리터를 제거하십시오.

다음으로 새로운 배지가 들어있는 시약 저장소를 실험실 자동화 로봇에 넣고 프로그램으로 웰당 200 마이크로 리터의 신선한 배지를 분주하고 100 마이크로 리터를 추가합니다. 이 단계를 두 번 수행하여 웰당 200마이크로리터에 도달합니다. 배지 교환 직후, 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다.

화합물 첨가가 될 때까지 격일로 배지 교환을 수행한다. 화합물 첨가 4-6시간 전에 22ml의 신선하고 따뜻한 분석 버퍼를 멸균 시약 저장소로 옮기고 실험실 자동화 로봇 옆에 두어 최종 배지 변경을 수행합니다. 중간 교환 직후 플렉시블 플레이트를 인큐베이터로 다시 옮깁니다.

기준선 측정 1시간 전에 플레이트를 각 측정 장치로 옮깁니다. 제어 소프트웨어에서 프로토콜 편집을 열고 각 측정 모드, 플렉스 사이트 또는 임피던스 EFP를 선택합니다. 프로토콜 번호를 저장하기 전에 스윕 지속 시간 또는 한 측정의 길이를 30초로, 반복 간격을 10분으로 정의합니다.

그런 다음 프로토콜 시작을 선택하고 요청된 필드를 계속 채웁니다. 파라미터가 설정되면 측정 시작을 선택합니다. 화합물 첨가 직전에 5분 간격으로 최소 3회의 기준선 측정을 수행합니다.

측정 장치에서 가요성 96-웰 플레이트를 제거하지 않고 각 웰에서 50 마이크로리터의 분석 완충액을 제거하고, 이어서 측정 계획에 따라 플레이트의 각 웰에 4배 농축된 화합물 용액 50마이크로리터를 첨가한다. 화합물 첨가 후 시약 마커 추가를 선택하여 화합물 플레이트 레이아웃과 복합 용액의 부피를 정의합니다. 그런 다음 실험 계획에 따라 표준 측정 진행 또는 측정 시리즈로 진행을 선택합니다.

대표적인 분석은 키나아제 억제제 Erlotinib이 인간 iPSC 유래 심근 세포의 수축성에 미치는 영향을 보여줍니다. 가장 낮은 농도에서 Erlotinib은 통계적으로 유의하지 않은 진폭 감소를 유도한 반면, Erlotinib의 마이크로몰 농도는 시간 및 용량 의존적 심장 독성 효과를 나타냈습니다. 효과의 시작은 하나의 마이크로 몰 Erlotinib으로 96 시간에서 나타 났으며, 10 마이크로 몰 Erlotinib으로 처리하면 화합물 첨가 후 24 시간이 크게 감소했습니다.

10 마이크로 몰 에피 루비 신 (Epirubicin)을 적용한 후, 세포는 24 시간 이내에 박동을 멈췄다. 하나의 마이크로 몰 에피 루비 신 (Epirubicin)을 적용하면 24 시간 후에 진폭이 급격히 감소한 후 48 시간까지 완전히 박동이 중단되었습니다. 100 나노 몰에서, 비트 진폭의 시간 의존적 감소가 관찰되었다.

10 나노 몰의 최저 농도에서 진폭은 꾸준히 변동하여 에피 루비 신의 효과가 용량 의존적임을 확인했습니다. 독소루비신 및 니페디핀으로 24 시간 동안 처리하면 농도 및 시간 의존적 방식으로 세포 생존율이 감소합니다. 증가하는 니페디핀 농도의 적용시, 세포에 대한 필드 전위 기록은 정규화된 필드 지속 시간의 농도 의존적 단축을 나타냅니다.

심장 수축력에 관한 니페디핀 평가는 또한 10 나노 몰 및 13 나노 몰 농도로 급성 측정시 상당한 농도 의존적 진폭 감소를 보였다. 세포는 일반적으로 온도 및 pH 변화와 같은 환경 매개 변수뿐만 아니라 수축판에서 특히 지원되는 기계적 시뮬레이션에 민감하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.