이 프로토콜은 전임상 생리 약물 검사를 위해 기증자 인간의 마음을 고용하는 기술을 연구원에게 제공하기 때문에 중요합니다. 이 조직은 인간 조직 조각에 있는 심장 작용 잠재력 및 세포내 칼슘 과도의 동시 특성화를 위해 전압과 칼슘 염료를 모두 활용합니다. 광학 매핑 시스템을 설정하려면, 하부 폴리디메틸실록산 젤 층을 가진 티슈 목욕을 관류 시스템에 부착하고, 온도를 유지하고 배스의 축적을 방지하기에 충분한 속도로 관류 시스템을 통해 100%의 산소로 산소화된 37도에서 1리터의 회수 용액을 순환한다.
그런 다음 대상을 사용하여 두 CMOS 카메라의 초점과 정렬을 조정하고 520 플러스 또는 마이너스 5 나노미터 파장을 가진 녹색 LED 광원을 사용하여 전압에 민감한 및 칼슘 표시기 염료를 동시에 자극한다. 조직 섹션을 얻기 전에 냉동 및 액체 심폐 액액을 혼합하고 심장 조직을 얼음 차가운 심폐 성 욕조에 넣고 왼쪽 심실 프리 월을 식별하십시오. 미리 만들어진 아가로즈 젤을 진동기의 금속 조직 홀더 뒷면에 붙입니다.
차가운 심근성 용액에 조직의 1 센티미터 큐브 블록을 잘라 신속하게 내막 표면을 향하고 금속 조직 홀더에 조직 블록을 장착하는 국소 피부 접착제를 사용합니다. 금속 홀더를 얼음 냉이 산소 슬라이스 용액의 진동기 욕조로 옮겨 조직이 완전히 침수되고 블레이드를 조직의 전면 가장자리로 이동시다. 진동을 켜서 미리 설정된 매개 변수로 슬라이스하기 시작하여 블레이드가 trabeculae를 넘어 매끄러운 내막 조직으로 도달 할 때까지 처음 여러 조각을 버립니다.
실험 조직에 도달하면 각 슬라이스를 각 조각을 각 조각을 실온산소티로드의 복구 용액을 포함하는 배양 접시에 조심스럽게 옮기고 메쉬 와셔로 슬라이스를 덮어 조직 조각을 컬링에서 유지합니다. 모든 슬라이스가 수집되면 각 슬라이스를 각 슬라이스를 6웰 플레이트의 개별 우물로 조심스럽게 옮기면 3밀리리터의 PBS가 들어 있습니다. 부드러운 흔들림으로 슬라이스를 헹구고 신선한 멸균 PBS로 이 과정을 세 번 반복한 후 샘플을 잘 37도의 섭씨 37도 배양 배지를 포함하는 6웰 플레이트의 개별 우물로 옮기.
그런 다음 플레이트를 분당 20회전에서 37도, 산소 30%, 이산화탄소 5%로 바톤에 놓습니다. 갓 잘라낸 슬라이스를 위한 회복 용액에서 20분 간 배양한 후, 관심 있는 조각을 관류 시스템 조직 배스로 조심스럽게 옮기고 4개의 모서리를 겔 층으로 고정시키면서 조직에 최소한의 스트레칭을 적용한다. 복구 용액의 저수지에 0.3 ~ 0.5 마이크로 리터의 마이크로 리터를 추가하기 전에 약 10 분 동안 순환 복구 솔루션으로이 욕조에서 슬라이스를 쉬게하십시오.
슬라이스가 Blebbistatin에서 배양하는 동안, 37도에서 복구 용액의 1 밀리리터에서 스톡 전압 에 민감한 염료의 30 마이크로 리터를 재구성합니다. Blebbistatin 처리의 10 분 후에, 펌프를 끄고 30 초의 기간 동안 슬라이스의 표면에 작동하는 염료 용액의 0.2 에서 0.3 밀리리터를 천천히 로드합니다. 90초 후 펌프를 켜서 과도한 염료를 씻어냅니다.
방금 입증된 것처럼 스톡 칼슘 표시기로 슬라이스를 죽은 후, 카메라를 슬라이스에 집중하고 소정의 속도 임계값의 진폭의 1.5배에서 2밀리초 펄스 폭 지속 시간으로 한 hertz에서 슬라이스를 페이스로 조정합니다. 조직 조각 위에 커버슬립을 놓고 LED 여기광원으로 슬라이스를 비춥습니다. 그런 다음 초당 1, 000 프레임으로 카메라로 방출 된 전압 및 칼슘 신호를 기록합니다.
전압 및 칼슘 광학 매핑 데이터를 조건으로 하려면 적절한 분석 소프트웨어에서 조건 매개 변수를 클릭하고 배경을 제거합니다. 그런 다음 신호 컨디셔닝 파라미터를 조정하여 최적의 작용 전위 및 칼슘 과도 추적을 얻습니다. 전도 속도를 계산하려면 활성화 맵을 선택하고 시작 및 종료 시간을 입력하여 추적에서 단일 작업 잠재력을 포괄합니다.
그런 다음 지역지도를 클릭하고 관심 영역을 선택하여 선택한 지역의 활성화 맵을 표시합니다. 다음으로 전도 속도 맵을 선택하고 시작 시간 및 종료 시간을 선택합니다. 필요에 따라 설정에 따라 픽셀 간 해상도 값을 조정합니다.
벡터 맵을 생성하여 관심 영역을 선택하고 해당 영역 내에서 전도 속도 벡터를 표시합니다. 상기 해석에 포함된 평균, 중앙값, 표준 편차 및 벡터의 수뿐만 아니라 선택된 지역에서 전도 속도 벡터의 전파의 평균 각도가 표시됩니다. 작업 잠재적 지속 시간을 계산하려면 작업 잠재적 기간, 칼슘 과도 지속 시간 맵을 선택하고 시작 및 종료 시간을 선택하여 하나의 전체 작업 잠재력을 포괄합니다.
그런 다음 지역 작업 잠재적 기간 계산을 클릭하여 관심 영역을 선택하고 작업 잠재적 기간 맵을 생성합니다. 상승 시간을 결정하려면 상승 시간을 선택하고 시작 시간 및 종료 시간을 선택하여 단일 작용 잠재력 또는 칼슘 과도의 업스트로크를 선택합니다. 시작 및 끝 백분율 값을 입력하고 계산을 클릭하여 관심 영역을 선택하고 상승 시간 분석에 포함된 평균, 중앙값, 표준 편차 및 픽셀 수를 결정합니다.
칼슘 부패를 결정하려면 칼슘 부패를 선택하고 시작 및 종료 시간을 입력하여 단일 칼슘 과도 신호의 전체 부패 부분을 포괄합니다. 그런 다음 타우 계산을 클릭하여 관심 영역을 선택하고 칼슘 부패 시간 상수 분석에 포함된 평균, 중앙값, 표준 편차 및 픽셀 수를 결정합니다. 이 대표적인 실험에서는, 작용 잠재력 및 칼슘 과도 추적은 신호 조절되었다.
활성화 시간은 각 픽셀에 대해 결정되었고 활성화 시간의 isochronal 지도는 조건부 전압 및 칼슘 흔적에서 플롯되었습니다. 전도 속도 벡터는 활성화 시간과 알려진 픽셀 간 해상도를 사용하여 계산하였다. 칼슘 과도 부패 상수는 칼슘 흔적의 부패 부분에 다형을 피팅하여 측정되었다.
작용 전위 기간과 칼슘 과도 지속 시간은 각각 세포질에서 재편광 또는 칼슘 제거의 활성화 시간과 지정된 퍼센트 사이의 시간 시간으로 측정되었다. 전압 및 칼슘 흔적의 상승 시간도 측정되고 매핑되었습니다. 본 대표적인 분석에서, 심장 전도에 대한 독소루비신의 효과는 횡전도 속도의 감소를 초래하는 시험되었다.
슬라이스 시술 시술 중 조직의 손상을 최소화하고 가능한 조각을 얻기 위해 조각이 완전한 심근 마비 체포에 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 프로토콜의 끝에서, 슬라이스는 분자 평가를 위해 동결되거나 고정될 수 있다. 관심의 전기 생리 학적 현상에 관련 된 기계성 경로 다음 결정 될 수 있습니다.
이 인간 적인 심장 슬라이스 모형의 발달은 동물과 임상 연구 사이 간격을 연결하는 인간 적인 심장 조직에 있는 처리 그리고 질병에 반응의 연구 결과를 허용했습니다. 이 기술을 수행하는 동안 인간 조직과 함께 작업 할 때, 적절한 PPE를 착용하고 다른 필요한 안전 예방 조치를 취해야합니다.
