이 방법을 사용하면 기존 MEA에서 세포 내 유사 활동 전위를 기록할 수 있으므로 AP 모양을 더 잘 설명하고 부정맥 전위를 보다 민감하게 분류할 수 있습니다. 일반적인 전위 기록과 비교하여 세포 내 유사 실제 전위 모양은 기본 이온 채널의 정확한 승인에 대한 더 많은 통찰력을 제공합니다. 줄기세포 기술을 통해 임상 환자로부터 유래된 심근세포에 적용할 경우, 이 방법은 원인적 진단 및 CRP의 개인화에 기여할 수 있으며, 부정맥과 같은 심장 질환 기술자인 Karin Gebhardt는 심근세포 배양을 시연할 것이다.
이전에 오토클레이브된 MEA의 전극장 코팅을 시작하려면 층류 후드 아래에 10마이크로리터 피펫을 사용하여 피브로넥틴을 적가합니다. 삼투압 충격을 줄이려면 해동 된 심근 세포가 들어있는 50 밀리리터 튜브에 도금 용액을 90 초 동안 적가하십시오. 8 밀리리터의 도금 매체를 튜브에 부드럽게 첨가하고 셀 현탁액을 조심스럽게 혼합하십시오.
10 밀리리터 피펫을 사용하여 상청액을 제거하고 펠릿을 버리지 않도록하고 세포 수를 최종 농도로 조정하십시오. 셀 안착 전에 10 마이크로리터 피펫을 사용하여 MEA 전극 영역으로부터 도포된 코팅 용액을 제거한다. 코팅의 건조를 피하기 위해 즉시 4 마이크로 리터의 셀을 6 웰 MEA 및 1 웰 MEA 모두에 대한 전극장에 적가하여 셀을 시드하십시오.이제 셀이 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 1 시간 동안 웰에 부착되도록하십시오.
층류 후드 아래에 6개의 웰 MEA 및 단일 웰 MEA에 대해 각각 섭씨 37도로 가열된 200마이크로리터와 1밀리리터의 멸균 도금 매체를 추가합니다. MEA 기록의 경우 MEA 칩 홀더가 대물 구멍 중앙에 오도록 MEA 시스템을 장치 위에 놓습니다. 그런 다음 MEA 설정을 배치하여 레이저가 전극에 초점을 맞추도록 하여 대물렌즈가 MEA 시스템의 구멍 바로 아래에 있도록 합니다.
세포가 기계적 교란으로부터 회복될 수 있도록 하려면 배양된 세포가 있는 MEA 칩을 기록 15분 전에 인큐베이터에서 MEA 설정으로 옮깁니다. 그런 다음 이소프로판올 면봉을 사용하여 접촉 패드와 핀을 조심스럽게 청소하여 소음 수준을 줄입니다. MEA를 MEA 설정에 조심스럽게 배치하고 오른쪽에 일련 번호가 보이는 6웰 MEA 칩 또는 왼쪽에 기준 전극이 있는 단일 웰 MEA 칩을 배치합니다.
이제 MEA 시스템 통합 난방을 섭씨 38도로 설정하십시오. 통합 안전 스위치는 덮개가 MEA 칩 위에 닫혀 있는 경우에만 레이저를 활성화할 수 있으므로 장치의 덮개를 닫습니다. MEA 구성 프로그램을 사용하여 고역 통과 및 저역 통과 MEA 시스템 필터를 각각 0.1 헤르츠 이하 및 3, 500 헤르츠로 설정하십시오.
MC 랙 소프트웨어 또는 대체 소프트웨어를 사용하여 녹음하십시오. 실험에 따라 입력 범위를 조정하십시오. 신호가 증폭기와 샘플링 속도를 포화시키지 않는지 확인합니다.
소프트웨어의 장기 표시 기능을 사용하여 녹음을 확인하십시오. MEA 칩을 MEA 설정에 삽입하고 소프트웨어를 설정한 후 FB ALP 소프트웨어를 사용하여 레이저 역학을 초기화합니다. 이제 초기화 버튼을 클릭하십시오.
초기화가 끝나면 가상 레이저 포인트는 6 개의 웰 MEA의 경우 웰 D에, 단일 웰 MEA의 경우 왼쪽 하단에 각각 있습니다. 그런 다음 마우스 클릭으로 제어 키를 사용하여 가상 레이저 포인트를 D five 전극의 중앙으로 이동하고 제어 키를 누른 상태에서 마우스 휠로 스크롤하여 초점을 조정합니다. 또는 자동 초점 기능을 사용하십시오.
버튼을 누르면 P one 설정 가상 레이저 포인트가 자동으로 우물 F로 이동합니다. 실험 요구 사항에 따라 레이저 출력과 공정 시간을 조정하십시오. 레이저를 활성화하려면 레이저 켜짐으로 표시되는 레이저 끄기 버튼을 클릭하고 녹음 소프트웨어로 전환하십시오.
파일 이름을 선택하고 빨간색 기록 버튼을 클릭한 다음 창 상단의 재생 버튼을 클릭하여 측정값을 기록합니다. 레이저로 세포를 열기 전에 60초 동안 기준선을 기록한다. 초기화 소프트웨어로 다시 전환하고 소프트웨어 창의 오른쪽에 있는 가상 맵에서 레이저에 의해 제외될 전극을 비활성화합니다.
레이저를 시작하려면 Alt 마우스 클릭을 사용하고이 우물의 중심 전극을 선택하십시오. 이것은 레이저가 이 웰의 각 전극 상의 셀을 자동으로 개방하도록 개시하고, 각 웰에 대해 반복하여 이 선택된 웰의 이전에 활성화된 모든 전극을 개방한다. 니페디핀 E-40 31의 밀리몰 농도를 DMSO에 먼저 용해시킨 다음 완전한 배지에서 원하는 농도의 10 배로 용해시킵니다.
우물에서 0.1%의 최종 DMSO 농도를 초과하지 마십시오. 60초 동안 기준 활동을 기록합니다. 앞에서 설명한 대로 레이저 유도 퍼레이션을 시작하여 FPS를 liAP로 변환합니다.
모든 약물을 우물 당 단일 농도로 적용하십시오. 6개의 웰 및 단일 웰 MEA에서 각각 웰당 20마이크로리터 및 100마이크로리터의 배지를 제거합니다. 측정할 약물 저장 용액 20 마이크로리터 또는 100 마이크로리터를 웰에 첨가한다.
MEA 유형에 따라 조심스럽게 위아래로 2-3 회 피펫하십시오. 화합물을 300초 동안 씻어내십시오. 이 시간 동안, liAP 형상은 FP 형상으로 변형될 수 있다.
다시, 유도된 레이저 유도 퍼레이션을 추가 60초 동안 liAP에 가능한 화합물 유도 결함을 기록합니다. 니페디핀의 첨가는 농도 의존적 방식으로 liAPs의 고정상 단계를 감소시키고, 이로써 전체 liAP를 단축시켰다. 이 단축은 조작되지 않은 전극으로부터의 심근 세포의 전계자 전위와 비슷했다.
E-40 31은 관련 KV 1 점 11 칼륨 채널의 재분극을 억제하고 증가 된 농도에서 심근 세포의 부정맥 거동을 유도했다. 또한, E-40 31은 농도 의존적으로 liAP 지속시간을 증가시켰다. liAP의 끝에서 0.1 마이크로 몰에서 작은 양의 전압 편향이 관찰되었으며, 이는 더 높은 농도에서 더 두드러졌으며, 이는 EAD라고하는 일시적인 새로운 탈분극을 나타냅니다.
0.1 마이크로 몰의 최고 농도에서 이러한 EAD는 시간이 지남에 따라 이소성 박동으로 확대되었습니다. 조기 활동 전위입니다. EAD와 이소성 박동은 프로 부정맥 활동의 핵심 지표입니다.
그리고 결국, 전기적 활동은 부정맥 박동을 초래합니다. 농도 반응 관계는 FP 및 liAP 기록과 상관 관계가 있습니다. 또한, 도페틸리드의 존재 하에서, FP 및 liAP 모두 동일한 웰 내에서 약 2초의 지속시간을 표시하였고, FP 파형은 규칙적인 재분극 편향을 나타내었다.
liAP에있는 동안 EAD는 감지 할 수 있습니다. 초점이 맞지 않는 현미경 이미지가 세포의 개방에 영향을 줄 수 있으므로 각 멜로멘 전에 초점을 조정하는 것이 중요합니다. 또한 옵터레이션을 분석에 사용해야 하는 직후에 활동 전위가 측정됩니다.
이 기술은 표준 MEA에 비해 이전의 부정맥 효과를 감지하는 데 더 민감하여 부작용을보다 정확하게 감지 할 수 있습니다.
