이 작품은 건강 보조금 2R01 GM53132 및 P50 GM071558 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 칼슘 지표로로드 셀 <ol><li> 35mm 유리 바닥 MatTek 요리의 플레이트 세포 (또는 챔버 스를 보는 다른 유리 바닥). </li><li> 10μg/ml laminin과 함께하기 전에 실 일일 기본 myocytes 코트를 사용하는 경우. 킬로바이트 버퍼 (K - 반전 Tyrode 버퍼에 플레이트 심장 myocytes (어른 개, 신생아 쥐, 또는 다른 유기체에서 격리) 35 HEPES의 mmol / L, 140 KCl, 8 mmol / L KHCO 3 / 2 mmol의 mmol / L MgCl 2 L 및 0.4 KH 2 PO 4, 산도 7.5의 mmol / L)와 37 15% 태아 소 혈청과 1 % streptamycin와 0.5 % gentamicin과 부화로 보충 M199 중간에 점차적으로 그것을 변경 ° 5 % C CO 2. </li><li> 또는 실온에서 30-45 분에 대한 원하는 표시 칼슘, 칼슘 녹색 AM (분자 프로브 1-5 μm의)와 세포를 품어. 염료의 photobleaching 피하기 위해 알루미늄 호일로 접시를 커버. </li><li> 14mM EGTA과 Leibovitz15 매체 (과 셀 세 번 씻으십시오낮은 칼슘 실험) 또는 적절한 보는 미디어를 수행하는 경우. </li><li> Leibovitz15 중간 containing14mM EGTA 다른 30~45분에 대한 품어. </li><li> 억제제의 효과를 테스트하는 경우 (예 : 10μM U73122 PLC 억제제) 두번째 부화하는 동안 그들을 추가할 수 있습니다. </li></ol> 2. Microinjecting 세포 <ol><li> 24 유리 바닥 MatTek 요리 (또는 다른 볼 실)에 문화 cardiomyocytes. </li><li> 14 MM EGTA과 페놀 무료 Leibovitz - 15 매체를 변경 (cardiomyocytes은 칼슘 무료 매체 주입해야, 다른 세포는 중간 들어있는 칼슘 주입 수 있습니다.) </li><li> microinjection 솔루션을 준비 - 우리의 연구는 Gα Q를 제거하는 펩타이드를 사용 - caveolae 상호 작용. 볼륨에만 소량 세포 (~ FL)에 주입되고 있으므로 합리적인 농축 주식을 사용해야한다는 것을 명심하십시오. 우리는 칼슘없는 매체 DAPI이 펩타이드 2 μm의, Cav3 - 발판을 이용하였습니다. DAPI은 블루입니다E 염색되는 얼룩 핵 및 microinjected되었습니다 세포의 식별을 허용합니다. DAPI는 많은 칼슘 지표의 형광을 방해하지 않습니다. DAPI의 금액은 변수이고 우리는 일반적으로 (0.5과 2 μm의) 핵을 시각화하기에 충분한 사용 </li><li> 혼자 염료 추적기 - DAPI를 포함하는 제어 솔루션을 준비합니다. </li><li> microinjections 자기 뽑아 또는 상용 바늘을 사용하십시오. 적절한 바늘 매개 변수를 결정하는 색소 분사로 연습합니다. 우리는 서로 다른 세포가 다른 바늘 직경 및 microinjection 압력을 필요로 수도 있습니다. </li><li> 예를 들어 Eppendorf에서 FemtoJet 펌프 InjectMan NI2에 대한 자동 microinjection 시스템을 사용합니다. 90 사출 압력 P I 고전력 증폭기, 그리고 45 보상 압력 P C 고전력 증폭기를 설정합니다. 0.7로 사출 시간 t를 설정 S. 필요로 주입의 매개 변수를 정리하다. </li><li> 거꾸로 현미경 (예 : 자이스 혈구 Axiove에 microinjections를 수행RT 200M)는 긴 작동 거리 위상 콘트라스트 목적 (예 : 공기 40x 2 단계 목표에 대한)를 갖추고 있습니다. </li><li> 빠른 패션 가능한 많은 세포로 주입. 가능한 셀을 선택 위상 콘트라스트를 사용하여 주입 세포를 검사합니다. </li></ol> 3. 공동 연구 immunofluorescence <ol><li> PBS로 두 번 세포를 깨끗이 씻어 30 분 3.7 %의 paraformaldehyde로 고정시킨다. 필요한 경우, 전지가 고정되기 전에 자극 수 있습니다. </li><li> PBS로 고정 셀에 세 번 씻어하고, 오분을 위해 PBS에 0.​​2 % NP40와 함께 품어. </li><li> PBS는 일시간에 대한 4 % 염소 혈청 (또는 기타 적절한 혈청)이있는 사용 차단. </li><li> 일시간 위해 PBS에 1 % 염소 혈청과 적절한 희석에 차 항체와 세포를 품어. </li><li> 이러한 알렉사 - 형석 - 488 안티 토끼이나 알렉사 - 형석 - 647 희석 방지 마우스 차 항체로 형광 - 분류 이차 항체의 추가, 다음 150 MM NaCl, 25 MM 트리스, pH를 7.6로 10 분 동안 세포를 세 번 씻으십시오 1: PBS 1000 1 % 염소 혈청 (두 개의 다른 단백질에 대한 탐색시 기본 항체가 종에 제기해야하며 보조는 해당 종에 대한 있어야합니다.) </li><li> 37 품어 ° C 일시간 들어, TBS로 세 번 씻는다. </li><li> TBS 버퍼 또는 다른 적절한 보는 매체에 세포를 볼 수 있습니다. </li></ol> 4. 빠른 칼슘 이미징 <ol><li> (예 : Fluoview 1000 올림푸스) 공촛점 현미경 스캐닝 레이저를 사용합니다. </li><li> 높은 수치 조리개 목표를 사용하십시오. </li><li> 인수 매개 변수를 설정합니다. 칼슘 녹색 사용 488 나노미터 여기와 긴 515 방사 필터를 전달합니다. </li><li> 픽셀 시간을 조정 - 빠른 칼슘 측정을위한 2 μs / 픽셀로 설정합니다. </li><li> 0.3 μm의 - 0.05의 픽셀 크기를 달성하기 위해 이미지 확대를 설정합니다. </li><li> 특정 지역에서 선택의 세포에서 라인을 선택합니다. </li><li> 시간 컨트롤러 창에서 시간 프레임을 원하는 얻으려면 적어도 1,500 스캔 (시간 획득을 선택응답 - 1.3 MS / 라인) 이초를 얻을 것입니다. </li><li> 기록 배경은 이전에 자극에 반응 없음. </li><li> 5 μm의의 carbachol와 세포를 자극하고 즉시 녹화 데이터를 시작합니다. 세포에게 Leibovitz15 매체의 한 ML에 보관, Leibovitz15 10 μm의의 carbachol를 준비하고 그릇에 부드럽게 한 ML을 추가 </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 기록된 이미지에서 각 픽셀에 대한 농도의 압축을 풉니다. Fluoview 1000 소프트웨어를 사용하여 테이블로 강도 데이터를 저장합니다. </li><li> Sigmaplot로 가져오기 강도 데이터 또는 유사한 데이터 분석 프로그램과 빈 ~ 90-40 방식으로 데이터입니다. 실험 및 전자 노이즈를 제어하는​​ 비교. </li></ol> 6. 대표 결과 : 우리는 멀티 라인 레이저 여기와 40x/1.2 NA의 고차 색지움 물 침지 목적 갖춘 공촛점 현미경 LSM510을 (자이스 혈구, 예나, 독일) 스캐닝 레이저에 세포를 몇 군데. 그림. 우리가 distributio을 보여주 1 (빨간색)N이 세포 구의 주요 구조 단백질이다 caveolar caveolin - 3 항체로 고정하고 스테인드되었습니다 송곳니 성인 심실 cardiomyocytes에 caveolae니다. Caveolin - 3는 알렉사 - 647과 함께 immunolabelled과 그에서 633 - nm의 라인 흥분되었습니다 NE 레이저. 이미지 LP650 NM 방출 필터를 사용하여 기록되었다. caveolin - 3의 배포는 알렉사 - 488 (녹색)와 immunolabeled되었습니다 Gα Q에 비해되었습니다. 알렉사 - 488은 488nm 아르곤 이온 레이저 라인 흥분되었고 이미지가 BP505 - 530nm 방출 필터를 사용하여 기록되었다. 이러한 colocalization 측정에서 두 fluorophores는 멀티 트랙 인수를 사용하여 순차 방식으로 흥분되었습니다. 이 절차는 채널 간 이야기 최소화합니다. colocalization위한 데이터 분석 자이스 혈구 LSM510 - 메타와 함께 제공되는 AIM 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 볼 수 있듯이, 두 단백질이 colocalized 있습니다. 확인하는 방법에 caveolin - 3 Gα 사이의 커플링 <suB&gt; Q 우리가 40x 목적 (UPlanApo, 올림푸스, 숫자 개구와 거꾸로 현미경 (IX70, 올림푸스)에 결합 공촛점 스캐닝 레이저 현미경 시스템 (Fluoview, 올림푸스, 도쿄, 일본)에 칼슘 이미징 연구를 실시, 칼슘 신호에 영향을 이러한 측정은 또한 Zeis 시스템에서 수행 될 수 있지만 1.3) 위에서 설명한. 이러한 측정, 세포는 칼슘 2 + 그린로드되었습니다. 우리는 488nm 아르곤 이온 레이저로 염료를 흥분하고 LP515 방사 필터를 통해 이미지를 수집했습니다. 이미지 프레임은 500 MS 간격으로 수집되었다. 각 픽셀에 대한 강도 값은 올림푸스 소프트웨어 및 ImageJ를 사용하여 추출되었습니다. 라인 스캔 모드는 빠르게 칼슘 2 + 과도 및 CA 2 + 불꽃의 정량 분석에 사용되었다. 현재 연구에 사용되는 픽셀의 크기는 0.1-0.3 μm의되었습니다. 라인 스캔 속도는 한 줄에 μs 백에 대한 몇 가지했다. 그림. 2 우리는 칼슘 2 라인 스캔 + 그린로드 cardiomyocyte 픽셀 D를 표시잘 시간이 2 μs 되었음 줄 시간이 142 μs되었습니다. 이미지가 1200 라인으로 구성되어 있습니다. 검사의 각 라인은 칼슘 2의 농도 변동에 해당하는 + 그린이 142 μs 범위에서 찍은 71 포인트의 구성, 그리고 칼슘 응답 읽기 밖으로 신속한으로 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 그림 인치 3 우리는 칼슘 2로 표시 칼슘 2 측정한 개인 cardiomyocyte의 단일 라인 + 활동 전에는 초 단위로 시간 함수 (위)로 후 + 녹색 형광 강도 (아래) 강화 5 μm의 제품 carbachol의 추가 세포내 칼슘 2 수준 + Gα Q - PLCβ 활동을 통해. 많은 라인이 평균 때, carbachol 자극은 칼슘 2 ~ 1.8 배 증가를 생산 + 그린 강도를. 실험 조건 변화 (상온, 레이저 파워 검출기 반응, 염료 배포판 등)으로 인해,이 증가는 개인에서 볼 수 없습니다라인 스캔합니다. 강도 값 (Y 축 값)이 유사하더라도, 그것은 바닥에 carbachol 자극 줄거리가 자극 전에 본적이 좁은 변동 봉우리보다 지속적인 칼슘 수준에 해당하는 많은 넓은 봉우리를, 그게 분명하다. 강도에이 확대와 상대적으로 상승 작고 느린 oscillations를 가린다. 우리의 목표는 더 나은 칼슘 변동 이러한 서로 다른 명백한 유형 간의 차별하는 것입니다. 이러한 빠른 칼슘 변동의 또 다른 예제는 그림에 표시됩니다. 4. 상단 그래프는 자극 심실 cardiomyocytes (적색) 및 3 라인 트레이스의 평균이 검정에 표시됩니다에 대한 원시 라인 데이터를 보여줍니다. 이러한 칼슘 변동이 Gα Q에 의해 중재되었다 그 범위를 확인하려면 - caveoline3 상호 작용을, 우리는 caveolin - 3 destabilizes 펩타이드 microinjected - 이상 칼슘 2 제거 Gα Q 상호 작용 (예 : Cav3 펩타이드) + 현재와 이러한 데이터를 파란색으로 표시됩니다(우리는 두 가지 성분이 더 잘 분별 수 있도록 Cav3 펩타이드의 농도에서 500을 빼는합니다.) 우리는 우리의 Excel 파일 Sigmaplot로 (Jandel 주식 회사)에서 원시 데이터의 열을 가져 히​​스토그램 분석을 실시. 이 분석에서는 이벤트의 번호는 히스토그램을 생성하기 위해 상자의 같은 숫자 (방식)로 분류됩니다. 빈의 너비 시간이 동일한 간격을 나타냅니다. 농도가 다른 시간에 삽입은 특정 빈의 높이가 적극성이 특정 시간 윈도우에서 발생하는 횟수를 나타냅니다 있도록 바인딩합니다. 이런 종류의 분석은 동일한 스캔 속도로 데이터를 수집에 따라 이후, 많은 흔적을 동시에 분석할 수 있습니다. 또한이 분석은 염색 수준의 차이, 레이저 파워 등, 전자 및 배경 잡음이 매우 빠른 시간 스케일에서 발생하는 구별하지 않습니다 오직 첫 번째 1-2 방식으로 볼 수 있습니다. 해당 histogra그림에있는 원시 데이터의 MS. 4 페이지의 하단에 표시됩니다. 제어 세포에 대한 히스토그램은 같은 레드 라인 (라인은 눈을지도를위한이며 모델이 가정되지 않습니다)에 의해 그려진 광범위한 시간 분포에 대응하는 방식의 다수에 걸쳐있다. 반면, Gα Q - Cav3 상호 작용은 펩타이드에 의해 방해되었다 세포의 반응에 대한 방식은 펩타이드의 존재가 더 이상 기간 fluxes를 제거 하자는 좁은 빈 배포에 국한되어 있습니다. Gα Q - Cav3를 방해하지 않는 제어 펩타이드의 Microinjection은 해제 주입 전지 8 유사한 히스토그램을 생산하고 있습니다. 그림. 5 우리는 + 성인 송곳니 심실 cardiomyocytes에서 그린 (왼쪽)와 신선한 칼슘 2의 빠른 강도 변동, caveolae을 (오른쪽)이 부족 unstimulated 쥐 신생아 cardiomyocytes을 비교합니다. 여기, 3 분 동안 농도의 해당 histograms은 binned되었습니다<html> 35 느린 칼슘 이벤트를 볼 수 있습니다. 신생아 cardiomyocytes보다 체계적인 기준이 성인 세포에 대해 볼 수있는 동안 느린 칼슘 2 + 활동의 부족을 보여주는 평면 기준에 빠른 변화를 표시합니다. 이러한 차이는 대부분 쉽게 histograms에서 볼 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig1.jpg" /> Gα Q의 분포를 보여주는 송곳니 성인 심실 cardiomyocytes의 그림 1. 이미지는 알렉사 - 488은 488nm 아르곤 이온 레이저 라인과 이미지로 흥분했다 알렉사 - 488과 함께 immunolabeled는 BP505 - 530nm 방출 필터를 사용하여 기록되었다. 오른쪽 상단은에서 633 - nm의 라인과 함께 기쁘게 생각 알렉사 - 647과 함께 immunolabeled caveolin - 3의 로컬 리 제이션을보고 똑같은 그림이야 그 : Ne 레이저와 LP650 nm의 방사 필터를 사용하여 기록했다. colocalization가 오렌지색에서 볼 수있는 병합 이미지가 오른쪽으로 확장 이미지와 왼쪽 하단에 있습니다. <html> &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig2.jpg" /> 그림 2. 살고있는 개과의 성인 심실 cardiomyocyte의 칼슘 이미징은 칼슘 2 + 그린로드. 이미지가 488nm 아르곤 이온 레이저와 LP515 방사 필터를 사용하여 40x 목적으로 공촛점 스캐닝 레이저 현미경 시스템에 찍은 거예요. 이미지가 1200 라인으로 구성되어 있습니다, 픽셀 시간이 2 μs했습니다 머물러, 그리고 픽셀 크기 0.1 μm의되었습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig3.jpg" /> 그림 3. 살고있는 개과의 성인 심실 칼슘 2 + 그린로드하고 설명 군데 cardiomyocyte, 그리고 하단 5 μm의 제품 carbachol의 추가에 의해 자극을 동일한 세포에서 라인 성분의 TOP 강도 변화. <html> / 3505fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4. 칼슘 2로드 살아있는 개과의 성인 심실 cardiomyocyte에서 라인 트레이스의 예를 들어 상위 3 트레이스의 평균은 검은 선으로 표시하고, microinjected되었습니다 세포에 비해 180 MS 점령 + 그린 (빨간색) 펩티드와 세 트레이스의 평균이 흑인에 Gα Q - caveolin 3 협회 (빨간색)를 방해. 우리보고를위한 데이터의 하위 집합에서 400 강도 계산을 빼는합니다. 하단 패널의 텍스트에서 설명한대로 binned 데이터의 해당 histograms이며, 빈 번호는 임의이며 빈 카운트 (또는 단순히 개수) 특정 병원에 강도의 합계 금액에 해당하는 경우. 우리는 통제 (왼쪽)와 펩타이드 (오른쪽) histograms에 그려진 라인 빨간색과 파란색 라인이 데이터를보다 쉽게​​ 식별 및 비교 수 있도록하고 어떤 모델이 가정되지 않습니다. files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg &quot;/&gt; 그림 5. 칼슘 2 강도 변동이 + 성인 송곳니 심실 cardiomyocytes에서 그린 (왼쪽)와 caveolae (오른쪽)와 해당 histograms 부족 신선한 unstimulated 쥐의 신생아 cardiomyocytes은 다음과 같습니다.

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	<li>Cheng, H., Lederer, M. R., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks+and+[Ca2+]i+waves+in+cardiac+myocytes.">Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 270, 148-159 (1996).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Sparks.">Calcium Sparks.</a> Physiol. Rev. 88, 1491-1545 (2008).</li><li>Rebecchi, M. J., Pentyala, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+control+of+phosphoinositide-specific+phospholipase.">Structure, function, and control of phosphoinositide-specific phospholipase.</a> C. Physiol.Rev. 80, 1291-1335 (2000).</li><li>Suh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+phosphoinositide-specific+phospholipase+C+isozymes.">Multiple roles of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes.</a> BMB reports. 41, 415-434 (2008).</li><li>Schlegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowded+little+caves:+structure+and+function+of+caveolae.">Crowded little caves: structure and function of caveolae.</a> Cell. Signal. 10, 457-463 (1998).</li><li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+caveolae+membrane+system.">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199-225 (1998).</li><li>Sengupta, P., Philip, F., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1+alters+Ca2++signal+duration+through+specific+interaction+with+the+G{alpha}q+family+of+G+proteins.">Caveolin-1 alters Ca2+ signal duration through specific interaction with the G{alpha}q family of G proteins.</a> J. Cell. Sci. 121, 1363-1372 (2008).</li><li>Guo, Y., Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Ca2++Activity+in+Cardiomyocytes+through+Caveolae-G[alpha]q+Interactions.">Modulation of Ca2+ Activity in Cardiomyocytes through Caveolae-G[alpha]q Interactions.</a> Biophysical. Journal. 100, 1599-1607 (1016).</li><li>Rybin, V. O., Xu, X., Lisanti, M. P., Steinberg, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+targeting+of+beta+-adrenergic+receptor+subtypes+and+adenylyl+cyclase+to+cardiomyocyte+caveolae.+A+mechanism+to+functionally+regulate+the+cAMP+signaling+pathway.">Differential targeting of beta -adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase to cardiomyocyte caveolae. A mechanism to functionally regulate the cAMP signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 275, 41447-41457 (2000).</li><li>Tovey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+puffs+are+generic+InsP3-activated+elementary+calcium+signals+and+are+downregulated+by+prolonged+hormonal+stimulation+to+inhibit+cellular+calcium+responses.">Calcium puffs are generic InsP3-activated elementary calcium signals and are downregulated by prolonged hormonal stimulation to inhibit cellular calcium responses.</a> J. Cell. Sci. 114, 3979-3989 (2001).</li><li>Lohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ignition+of+Calcium+Sparks+in+Arterial+and+Cardiac+Muscle+Through+Caveolae.">Ignition of Calcium Sparks in Arterial and Cardiac Muscle Through Caveolae.</a> Circ. Res. 87, 1034-1039 (2000).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 생활 cardiomyocytes의 급속한 칼슘 신호를 확인하고 격리하는 방법을 개발했습니다. 이러한 측정의 실험 조건이 이전에 다른 전지 시스템 10뿐만 아니라 cardiomyocytes 11 적용되었습니다 있지만, histograms 및 빈 분석의 사용은 많은 칼슘 2 + 이벤트 인수로 데이터를 수 있습니다. 빠른 이벤트가 쉽게 자신의 근본적인 메커니즘을 이해하기 위해 적응 느린 것들과 모델에서 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes

Cardiomyocytes은 함수 1,2을 최적화하기 위해 함께 일할 시간을 변화의 여러 칼슘 2 + fluxes 있습니다. 칼슘 2에 변경 사항이 세포 요원에 대한 응답으로 + 활동은 주로 같은 아세틸콜린 3,4와 같은 에이전트에 의해 자극되는 플라즈마 막에화된 포스 포 라이 페이스 Cβ - Gα Q 경로에 의해 규제됩니다. 우리는 최근 caveolae 5,6 불리는 플라즈마 막 단백질 도메인이 Gα Q 7을 활성화 모함 수있는 것으로 나타났습니다. 이 함정 수사는 Gα Q의 활성 상태를 안정화하고 장기 칼슘 2 cardiomyocytes과 다른 세포 유형 8 + 신호를 발생하는 효과가 있습니다. 우리는 생활 cardiomyocytes의 빠른 규모로 역동적인 칼슘 반응을 측정하여이 놀라운 결과를 발견. 간단히, 세포는 형광 칼슘 2 + 표시와 함께로드됩니다. 우리의 연구에, 우리는 칼슘 2 + 그린 (Invitrogen에 사용칼슘 이온 결합에 따라 형광 방출 강도의 증가를 전시 C.). 형광 강도는 다음 공촛점 현미경 스캐닝 레이저 라인 스캔 모드를 사용하기위한 기록됩니다. 이 방법은 마이크로초 시간 스케일에서 시간 트레이스의 수백을 생산, 선택된 라인을 따라 픽셀 형광 강도의 시간 코스의 빠른 획득하실 수 있습니다. 이 매우 빠른 흔적은 Excel로 그리고 분석을 위해 Sigmaplot로 전송되며, 전자 노이즈, 무료 염료 및 기타 컨트롤에 얻은 성분에 비해 수 있습니다. 칼슘 2 해부하다 다른 흐름 속도 + 반응, 우리는 시간 픽셀 농도를 binned하는 히스토그램 분석을 수행했습니다. Binning은 스캔 500 성분 이상의 그룹의 우리를있게하고 하나의 플롯에 spatially과 temporally 컴파일된 결과를 시각화. 따라서 검사가 다른 피크 배치 및 소음에 의한 중첩 때 분별하기 어려운 속도가 느린 칼슘 2 +의 물결은 쉽게 볼 수있다binned histograms. 측정 시간 규모에서 매우 빠른 fluxes 더 칼슘이 반면, 매우 짧은 시간 용기의 농도의 좁은 분포를 보여 + 파도가 긴 시간 동안 용기 광범위한 배포와 binned 데이터를 보여줍니다. 이러한 서로 다른 시간 배포판은 우리가 세포에 칼슘이의 타이밍 + fluxes를 해부하다하고, 다양한 세포 행사에 미친 영향을 확인할 수 있습니다.

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Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

우리는 공촛점 현미경을 검색 레이저를 사용하여 살아있는 세포에 느리게 fluxes에서 신속하게 (마이크로초) 칼슘 이벤트를 분리하는 방법을 제시한다. 방법은 세포에 수백 픽셀의 기록 선 검사에 의한 칼슘 지표의 형광 강도 변화를 측정합니다. 히스토그램 분석은 우리가 다른 칼슘 fluxes의 시간 스케일을 분리 할 수​​ 있습니다.

Cardiomyocytes의 빠른 칼슘 Fluxes 측정

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.1K 조회수.  Queensborough Community College. 우리는 공촛점 현미경을 검색 레이저를 사용하여 살아있는 세포에 느리게 fluxes에서 신속하게 (마이크로초) 칼슘 이벤트를 분리하는 방법을 제시한다. 방법은 세포에 수백 픽셀의 기록 선 검사에 의한 칼슘 지표의 형광 강도 변화를 측정합니다. 히스토그램 분석은 우리가 다른 칼슘 fluxes의 시간 스케일을 분리 할 수​​ 있습니다.

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

연구

생물학

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

손쥐 심방과 심실 Cardiomyocytes의 절연 및 KV 채널 레코딩

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

분리 및 문화 신생아 마우스 심근

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

히드라의 글루타티온 유도 먹이 반응을 측정

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

이온 선택적 자체 참조 미세 전극 기술을 이용하여 세포 외 이온 플럭스 측정

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

C. 예쁜꼬마선충에서 RAN 펩타이드 독성 측정

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis of the screen is to generate a mutant population that can be screened with a phenotype of interest. EMS (ethyl methane sulfonate) is a commonly used alkylating agent for inducing random mutation in a classical forward genetic screen to identify multiple genes involved in any given process. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation is a key early signaling pathway that is activated upon stress perception. However the identity of receptors, channels, pumps and transporters of Ca2+ is still elusive in many study systems. Aequorin is a cellular calcium reporter protein isolated from Aequorea victoria and stably expressed in Arabidopsis. Exploiting this, we designed a forward genetic screen in which we EMS-mutagenized the aequorin transgenic. The seeds from the mutant plants were collected (M1) and screening for the phenotype of interest was carried out in the segregating (M2) population. Using a 96-well high-throughput Ca2+ measurement protocol, several novel mutants can be identified that have a varying calcium response and are measured in real time. The mutants with the phenotype of interest are rescued and propagated till a homozygous mutant plant population is obtained. This protocol provides a method for forward genetic screens in Ca2+ reporter background and identify novel Ca2+ regulated targets.

A forward genetic screen based on Ca2+ elevation as a read-out leads to identification of genetic components involved in calcium dependent signaling pathways in plants.

칼슘 신호의 새로운 표적을 확인하기 위해 트랜스제닉 칼슘 리포터 Aequorin을 사용하여 유전자 화면을 전달

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.