PO1 HL55798 (KL)를 미국 심장 협회 과학 발전 부여 0525532U (예)을 :이 작품은 보건 부여의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. murine aortas의 분리 절차의 기관 IACUC위원회의 승인은 마우스 작동하도록해야합니다. <ol><li> 50 ML PBS와 혼합하는 반전 튜브에 헤파린 나트륨 1000 단위를 추가하여 heparinzed PBS를 준비합니다. 혈액 및 수거 각 대동맥에 대한 PBS를 포함하는 컬렉션 튜브 빈 컬렉션 튜브를 준비합니다. 얼음의 모든 튜브 보관하십시오. </li><li> 그리기 혈액 (1000 U / ML 헤파린 나트륨의 0.1ml)을 주사기를 Heparinize, 수술 도구 (두 곡선 포셉의 쌍, 해부 가위, 그리고 microshears 한 켤레) 및 해부를위한 해부 무대를 준비합니다. </li><li> NIH와 설치류의 안락사에 관한 기관 IACUC위원회 정책을 다음과 승인 챔버의 이산화탄소를 사용하여 마우스를 안락사. 해부 단계로 마우스를 전송하기 전에 효과가 있는지 확인합니다. </li><li> 간단히 70 % 에탄올로 마우스를 흡수하고 해부 단계로 마우스를 고정. 심장 찔린 통해 마우스에서 혈액을 그립니다. </li><li> 복부와 가슴 충치를 엽니다. 25g의 바늘로 10 ML의 주사기를 사용하여 완전히 PBS 완전히 심장 주사하여 혈관에서 혈액을 제거하는 헤파린의 2 %를 포함하는으로 vasculature을 perfuse. 대동맥 조직 이내에 혈액이 없다는 것을 확인하십시오. 재관류는 선박 벽의 모든 plaques가 그대로 유지되도록 약간의 압력으로 천천히 실시한다. </li><li> 내장 기관, genitourinary 기관, 횡경막과 비장, 신장, 심장, 그리고 대동맥은 그대로 둔를 해부하다하고 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 대동맥과 adventitia은 그대로두고, 멀리 대동맥의 지방 조직 및 패러 대동맥 림프절을 해부하다. , 대동맥 아치를 포함하여 전체 대동맥를 수집 오름차순, 내림차순 흉부와 복부 부분. PBS로 컬렉션 관에서 분리된 대동맥를 놓습니다. 격리 절차 동안 선박 촉촉한을 유지하려고합니다. </li></ol> 2. 단세포 suspensions의 준비 <ol><li> 1X 대동맥 해리 효소 주식 솔루션 (아데스)를 (125 U / ML Collagenase 타입 XI, 60 U / ML Hyaluronidase 타입 1 - S, 60 U / ML DNase I, 450 U / ML Collagenase 유형 I, 2.5에서 MLS 만들기 PBS는 Galkina 외에서 수정되었습니다. 7). 모든 효소는 시그마 - 알드리치에서 있습니다. 얼음 주식 효소 솔루션을 놓습니다. </li><li> 대동맥을 포함하는 컬렉션을 튜브에서 PBS를 제거합니다. 각 대동맥에 1X 아데스 2.5 ML를 추가합니다. 효소 소화를 촉진 또는 전체 대동맥 그대로두고 작은 조각으로 잘라 aortas. 37 1 시간 1X 효소 솔루션 aortas을 품어 ° C (느린 흔들림는 선택 사항입니다.) </li><li> 1 시간 보육에 따라 차별 aortas 전단 및 5ml 폴리 프로필렌 외과 튜브 (BD 팔콘)로 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 그들을 통과하여 소화 대동맥에서 단세포 suspensions을 준비합니다. 펠렛 원심 분리하여 세포 (400xg 5 분, 4 ° C). </li><li> 외과 버퍼 (PBS는 1 % BSA와 0.05 % 난 3 보충)의 1ml에있는 세포를 Resuspend하고 trypan 파랑, hemocytometer, 그리고 가벼운 현미경을 사용하여 대동맥 세포 현탁액에 존재 얼마나 많은 세포가 결정합니다. 소화 후 얻은 세포의 총 숫자는 마우스 연령 다이어트 또는 죽상 경화증의 정도에 따라 달라집니다. </li></ol> 3. 유동세포계측법의 염색법 <ol><li> 새로운 외과 튜브의 적절한 숫자를 라벨. 일반적으로 유동세포계측법 실험은 단일 색상 튜브, 적절한 형광 - 마이너스 - 원 컨트롤 (FMO) 8, 적절한 isotype 컨트롤 및 실험 튜브의 집합의 집합이 아닌 스테인드 제어 튜브를 가질 것입니다. 격리 수있는 대동맥 leukocytes의 제한된 숫자가 있으므로, 지라 leukocytes은 단일 제어 얼룩을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 우리는 대동맥 세포 suspensions를 얼룩이 표준 유동세포계측법 프로토콜을 사용합니다. 간단히, 외과 튜브 (S)로 대동맥 세포 현탁액에서 0.5 - 1x10 6 세포의 나누어지는을 전송. 원심 분리에 의해 외과 버퍼와 펠렛의 1ml 세포를 추가합니다. decanting하여 pelleted 세포의 표면에 뜨는를 제거합니다. </li><li> 실험 튜브, 형광 - 마이너스 - 원 튜브와 튜브에 대한 isotype FC 블록 솔루션과 항체 칵테일을 준비합니다. 튜브 및 손가락 영화 또는 세포를 resuspend을 부드럽게 소용돌이 모든 외과 버퍼에 FC 블록 (14.2μg/ml, 클론 2.4G2)의 100μl를 추가합니다. 상온에서 15-20분에 대한 샘플을 품어. </li><li> 항체 얼룩, isotype의 얼룩이나 FMO 제어 얼룩 칵테일을 준비합니다. 귀하의 예비 적정 실험에서 항체의 최적 농도를 결정합니다. FC 블록의 존재에서 샘플 튜브에 항체 칵테일 (100ul/0.5-1.0x10 6 셀)을 추가합니다. 4 20-30 분 품어 ° C를 어둠에 약해. </li><li> 각각의 튜브에 외과 버퍼의 1ml을 추가, 소용돌이 원심 분리하여 세포를 혼합하고, 펠릿 수 있습니다. 절차 한 번 더 반복합니다. </li><li> 뜨는 및 resuspend을 가만히 따르다2퍼센트 PFA의 300μl의 pelleted 세포. 흐름 cytometer에 샘플을 실행합니다. <ul><li> 참고 : 일반적으로 안티 CD45 항체는 (일반적인 백혈구 항원 표식) + leukocytes 나중에 게이트 CD45하기 위해 샘플의 모든에 추가됩니다 외에도 7, CD45 FMO 및 isotype 컨트롤로 CD45 + 임파구 게이트 곳으로 처음 사용해야합니다. CD45 표현 leukocytes 사이 다를 수 있습니다. </li><li> 참고 : 표면 항원 또는 낮은 이벤트 항원을 표현하는 저밀도를 감지하려면, 이러한 R - Phycoerythrin (PE) 또는 Allophycocyanin (APC)로 &quot;밝은 fluorochromes&quot;를 사용합니다. 또한, 드문 이벤트를 함께 몇 가지 일치 aortas을 풀링하여 감지할 수, 1 백만명 이상의 세포를 사용하는 경우, 테스트마다 사용하는 항체의 양은 비례 증가한다. </li><li> 참고 : 고립 aortas에서 최소한의 혈액 contaminations있다는 것을 보장하고 결과적으로 대동맥 세포 현탁액에서 몇 가지 실험에 추가 얼룩이 터 - 119, 7 적혈구 (RBC)에 의해 표현 항원에 대해 수행되었다. 혈액에있는 백혈구 (WBC)에 RBC의 수는 약 10x10 6 셀 / μl 8x10 3 셀 / μl하는 것입니다. 대동맥 샘플의 터 - 119의 표현에 따라 샘플의 혈액 파생 백혈구의 비율을 계산하실 수 있습니다. 일반적으로 우리는 대동맥 샘플에서 혈액 파생 WBC 미만 0.02 % 수 있습니다. (Fig.1) </li><li> 참고 : 효소 처리는 표면 항원의 표현에 영향을 미칠 수 있기 때문에 소화 효소에 저항이 관심의 항원에 대한 결정되어야합니다. 간단히, 주변 림프절 (PLN) 또는 비장의 작은 조각은 ° C. 37에서 1 시간 동안이나 효소 칵테일없이 incubated 아르 일시간 후, 항원의 표현은 유동세포계측법에 의해 결정됩니다. 효소 칵테일은 여러 표면 항원 (Fig.2) 7 아무런 영향을 미치지 않습니다. 다른 경우에는 효소 치료는 항원 표현의 상당한 손실 발생. 이 문제는 다른 세포 마커를 사용하여 피할 수 있습니다. </li><li> 참고 : 원하는 경우 라이브 / 죽은 세포 생존의 얼룩은 4 단계 이후에 수행할 수 있습니다. 일반적으로 라이브 / 데드 고칠수 죽은 세포 스테인 키트 (Invitrogen, 분자 프로브)를 사용합니다. 라이브 / 죽은 색소와 함께 세포를 얼룩이, 섞어 PBS와 소용돌이 1ml에 다시 용해 죽은 / 라이브 염료의 1μl를 추가하여 1X 라이브 / 데드 솔루션을 만들 수 있습니다. 죽은 / 라이브 싱글, 칵테일, FMO 및 isotype 제어 샘플을 1X​​ 라이브 / 데드 염료 100-200 μl를 추가합니다. 어둠 속에서 10 분 동안 상온에서 염색과 샘플을 품어. 에 대한 단일 제어 튜브가 죽었 / 라이브 56 incubated되어야 ° 열 충격에 의해 세포를 죽일 10 분 동안 어둠 속에 C. 원심 분리하여 PBS 및 펠릿 세포 1 ML있는 세포를 씻으십시오. 5 단계에서 프로토콜을 재개. </li><li> 참고 : 세포 항원 및 크린 시토킨에 대한 세포내 얼룩이 프로토콜과 호환됩니다. 관심의 항원에 따라 - 잠깐요, 세포내 얼룩이 eBioscience BD Pharmingen, 또는 Caltag 실험실에서 세포 고정 / permeabilization의 시약을 사용하여 수행할 수 있습니다. 수정 및 세포 얼룩에 대한 세포를 permeabilize하려면 세포 얼룩 단계 (제 3 단계 5) 이후 제조 업체의 지침에 따라 고정 / permeabilization 단계를 수행합니다. 세포 세척 단계에 따라 6 단계 (제 3 단계 6) 저희 프로토콜을 재개하십시오. </li></ul></li></ol> 4. 절연 주변 adventitia 및 선박 벽 유동세포계측법 분석 leukocytes가 유동세포계측법에 의해 adventitial과 대동맥 leukocytes을 확인하기 위해 대동맥 adventitia뿐만 아니라 대동맥 벽 내에 atherosclerotic plaques 마이 그 레이션 수 있듯이이 두 해부 사이트에서 유동세포계측법를 분리하고 수행하기위한 프로토콜이 개발되었다. 9 간단히, 전체 aortas 전에 아데스 (제 2 단계 2) 대동맥 adventitia 부분적으로 소화하고 선박의 나머지 부분에서 제거로 소화하고 있습니다. adventitia 제거하고 따로 설정되면, 대동맥의 나머지는 혈관 벽에서 leukocytes을 해방하기 위해 아데스와 소화합니다. <ul><li> 대동맥 Adventitia 격리 프로토콜 </li></ul><ol><li> 1X 아데스 (제 2 단계 중 1 단계)의 준비에 따라, 2.5 ML / 1X 대동맥 adventitia의 소화 효소 솔루션 (AADES) (781.25 U Collagenase II 및 2.5mls PBS (워싱턴 생화학 공사, 레이크 우드, 뉴저지에서 14.0625 U 엘라스타제의 대동맥을 준비 사용까지 얼음)) 9. 플레이스 주식 솔루션입니다. </li><li> 대동맥을 포함하는 컬렉션을 튜브에서 PBS를 제거합니다. 각 대동맥에 1X AADES 2.5 ML를 추가합니다. 작은 조각으로 aortas를 잘라하지 마십시오. 37 10~20분에 대한 1X adventitia 효소 솔루션 aortas을 품어 ° C. </li><li> 10-20분의 소화에 따라, 신선한 PBS와 페트리 접시에 1X AADES의 일부 소화 대동맥을 전송합니다. 매우 신중하게, 멀리 천 adventitial 계층 껍질, 곡선 포셉 두 쌍을 사용하나의 단위로 톰 대동맥. <ul><li> 참고 : 긴 소화 시간이 쉽게 adventitia를 제거하게되지만, adventitia가 과다 소화있다면 그것은 눈물 것입니다. </li></ul></li><li> adventitia가 완전히 제거된 경우, adventitia 및 별도의 외과 튜브에 대동맥을 전송하기만하면됩니다. adventitia 튜브에 PBS의 1ml을 추가하고, 얼음 튜브를 놓으십시오. 대동맥 관에 1X 대동맥 해리 효소 솔루션 2.5 MLS를 추가하고 37 40 분 대동맥을 품어 ° C. <ul><li> 참고 : 효소 소화를 촉진하기 위해 대동맥이 시점에서 작은 조각으로 나누어 수 있습니다. </li></ul></li><li> 40 분 소화 다음, 얼음에 대동맥 관을 배치하고 차별 aortas 및 adventitia 전단 및 5ml 폴리 프로필렌 외과 튜브 (BD 팔콘)로 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 그들을 통과하여 대동맥과 adventitia에서 단세포 suspensions을 준비합니다. 펠렛 원심 분리하여 세포 (400xg 5 분, 4 ° C). 제 2 단계 4로 돌아가서 프로토콜을 재개한다. </li></ol> 5. 대표 결과 여기 우리는 전체 aortas의 면역 구성, 대동맥 혈관 벽과 그 주변 대동맥 adventitia을 분석 얼룩 유동세포계측법를 보여줍 수치의 번호를 제시한다. 첫째, 우리는 전체 혈액과 절연 대동맥 세포 현탁액 (그림 1)에 터 - 119 염색법을 보여줍니다 대표적인 외과의 계획을 보여줍니다. 터 - 119 긍정적인 적혈구가 대동맥 세포 suspensions으로부터 격리 세포의 유일한 0.014 %가 혈액 파생되는 나타내는 대동맥 세포 현탁액에서 세포의 18 %를 차지한다. 이것은 확실히 소화 혈관을 보여주는 중요한 제어 실험이지만, 주변 혈액 순환하지 않는 것은 대동맥 세포 현탁액에서 분석해 가장 leukocytes의 소스입니다. 또한, 방법을 검증하기 위해, 우리는 splenocyte 표면 항원에 대동맥 해리의 효소 칵테일 (그림 2)의 효과를 평가. 효소 칵테일을 포함한 여러 항원, CD45, CD19, 인 경우에는 3 번 CD, TCRαβ TCRγδ 여러 다른 표면 항원 7 표현에 아무런 영향을 미치지 않습니다. 데드 / 라이브 생존의 염료와 적절한 isotype 컨트롤과 함께 CD45 얼룩은 감지하고 관심의 하위 게이트 주요 인구 및 분석하는 동안 세포 잔해를 제외하는 데 사용됩니다. Fig.3, 라이브 대동맥에서 CD45 + leukocytes는 IFN의 비율을 결정하는 문이되었다 Υ 두 젊은 Apoe의 풀링 aortas 이내 + T 세포 - / - 마우스. Fig.3에 표시되는 게이팅 방식을 사용하여이 방법의 융통성을 강조하기 위해 두 Apoe에서 CD68 + CD11b + macrophages와 IFNγ + TCRαβ + 전지 Fig.4 대표 세포 얼룩에 존재 - / - 12 마우스 공급 웨스턴 다이어트 주. / - - 마찬가지로 서양 음식 먹은 Apoe에서 예상. aortas, 대동맥 내에서 leukocytes의 대부분은 macrophages (40 % CD68 + CD11b +) 또는 기타 골수양 세포 (CD11b + 낮은 CD68와 CD11b + CD68 -)입니다 또한, Th1 세포는 T 세포 TCRαβ (Fig.4)를 침투 대동맥의 주요 부분을 구성. 대동맥 leukocytes 및 백혈구 하위 집합의 전체 비율은 마우스와 죽상 경화증의 심각의 연령에 따라 다릅니다으로 관심의 주요 인구를위한 최적의 게이팅 전략은 경험적으로 결정되어야 유동세포계측법의 얼룩에 대한 대동맥 adventitia를 분리의 가능성을 입증하기 위해, 우리는 대표 CD45을 제시 + 대동맥과 adventitial 세포 suspensions에 대한 백혈구 얼룩 (그림 5). 간단히 세 노인 Apoe - / - 마우스 aortas은 소화되었고 위에서 설명한대로 (제 2 4) 함께 풀링. CD45 +의 leukocytes을 침투하기 adventitia (세포 현탁액의 18 %) 나머지 대동맥 (세포 현탁액의 11 %) 모두에서 발견되었다. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 소화 대동맥 세포 현탁액의 터 - 119 얼룩. 대동맥은 PBS 2 %의 헤파린을 포함과 심장 관통하여 perfused했다. 그러면 대동맥은 ° C.는 37에서 1 시간을위한 효소 칵테일과 함께 소화했습니다 대동맥 세포 서스펜션 및 혈액 샘플은 (긍정적인 제어 등) 방지 - 터 - 119 - PE 애비와 스테인드 및 유동세포계측법에 의해 분석되었다. aortas으로부터 격리 모든 leukocytes만이 0.014 %가 혈액 파생 leukocytes 될 가능성이 나타내는 대동맥 세포 현탁액의 모든 세포의 18 %를 터 - 119 - 긍정적인 적혈구 계정. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 효소 - 칵테일 치료 CD45 (상단) 또는 CD19 (아래) lymphocytes에 표정에 아무런 영향을 미치지 않습니다. </stronG&gt; 치료 (A, B)와 효소 - 칵테일 (C, D)로 치료에서 세포 suspensions LN은 취득하고, APC - Cy7 - 복합 백신 CD45과 APC - 복합 백신 CD19 mAbs 물들일되었습니다. (A, C) 번호 R1 게이트에서 CD45 +의 leukocytes의 비율을 나타냅니다. (B, D) 번호 CD45 + / CD19 + lymphocytes의 비율을 나타냅니다. 프로필 CD45 +의 leukocytes에 문이있다. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3 대동맥 leukocytes의 분석을위한 게이팅 전략 두 aortas가 atherosclerotic 경향이 Apoe으로부터 격리 및 풀링된 했어요 -.. / - 위에서 설명한대로 마우스 및 대동맥 세포 suspensions이 준비되었습니다. 셀 suspensions은 CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), IFNγ (eFluor 450), 그리고 죽은 / 라이브 아쿠아에 대한 스테인드, 그리고 BD 외과 Calibur을 업그레이 드 Cytek DXP 8 컬러를 사용하여 분석했다. 간단히, CD45 +의 Leukocytes은 문이 있었다 (B) 및 추가 (CF) 분석했다. 죽은 세포가 죽었 / 라이브 아쿠아 얼룩 (D)와 FSC 플롯 (E)에 따라 분석에서 제거되었습니다. 라이브 대동맥 leukocytes 그런 다음 TCRαβ와 IFNγ 표현 (F)를 검사했다. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig4.jpg" alt="그림 4"/> 설명한대로 대동맥과 비장 -.. / - 그림 4 세포 항원 및 크린 시토킨에 대한 세포내 얼룩 세포 suspensions은 전체 Apoe에서 준비되었다. 대동맥 (A)와 (B, C) 지라 세포 suspensions는 CD45, CD11b, 그리고 CD68 또는 BD Cytofix / Cytoperm ™ 키트 (BD Biosciences)를 사용 isotype 제어를위한 스테인드되었습니다. 세포는 CD45 +의 leukocytes에 문이되었고 부스러기는 앞으로 및 측면 산란 프로파일에 따라 제외했다. 세포내 IFNγ의 얼룩 경우, 대동맥 및 지라 세포 suspensions 미리 설명한 바와 같이, 잠돌군 Zz 중지, PMA, 그리고 Ionomycin C로 보충 RPMI 1640에서 다섯 시간 동안 교양되었습니다. 9 셀 suspensions했던 단일 대동맥 (D)과 지라를 (E, F) 자극 또는 isotype (IgG1 - eF450, F); 이후 CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), 인 경우에는 3 번 CD (APC - Cy7) 물들일, 데드 아쿠아, 그리고 IFNγ (E eFluor 450) 살고 있습니다. T 세포 (DF)는 문이 라이브 CD45 + 인 경우에는 3 번 CD +에서 leukocytes (CD45 + 데드 / 라이브 아쿠아)되었으며 TCRαβ와 IFNγ에 대한 검사. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig5.jpg" alt="그림 5"/> .. / - - 마우스 그림 5 격리 murine 대동맥 adventitia 및 대동맥 혈관 벽 대표 이미지는 대표 유동세포계측법 카운터 줄거리는 CD45의 존재 + 노인 Apoe의 adventitia과 대동맥 벽에 T 세포를 보여줍니다. SSC - 사이드 흩뿌리다. 파편과 괴사 조직의 autofluorescence를 제거하기 위해 플롯은 FSC&gt; 750에 대한 문이 있었다. 게이츠는 또한 FSC &lt;3500, SSC &lt;3500로 설정되었습니다 doublets에서 추가 autofluorescence를 피하려면. 비율은 게이츠의 CD45 + 세포를 나타냅니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기, 우리는 murine aortas의 면역 세포 조성의 조사를위한 흐름 cytometry 기반의 방법을 제시한다. 이 방법의 가장 큰 장점은 단일 세포 수준에서 대동맥 면역 세포를 분석하고 대동맥 leukocytes의 정품 인증 상태를 특징하는 능력입니다. 이 방법은 murine aortas로 제한하고 (발표되지 않은 데이터) 등 10 등 내유 동맥, 대동맥 밸브 및 관상 동맥과 같은 인간의 표본을 분석하기 위해이 접근법을 사?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 자료 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 회사 </td></tr><tr><td> Collagenase XI </td><td> C7657 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> H3506 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td></tr><tr><td> DNase I, 2를 입력합니다 </td><td> D4527 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td></tr><tr><td> Collagenase I </td><td> C0130 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td></tr><tr><td> Collagenase II </td><td> LS004174 </td><td> 워싱턴 생물 코퍼레이션 </td></tr><tr><td> 엘라스타제 </td><td> LS002292 </td><td> 워싱턴 생물 코퍼레이션 </td></tr></tbody></table>

flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas

죽상 경화증은 거품 세포, 면역 세포, 혈관 내피 및 평활근 세포, 혈소판, 세포외 기질, 그리고 광범위한 괴사와 지질이 풍부한 코어로 구성된 plaques의 형성에 의해 특징 있으며 중간 및 대형 선박의 만성 염증성 과정 주변 조직의 섬유증. 면역 반응 1 타고난과 적응 무기가 죽상 경화증의 개시, 개발 및 지속성에 참여합니다. 2, 3이 증거의 중요한 기관이다 같은 macrophages로 면역 세포의 서로 다른 하위 집합, 돌기 그 세포, T 및 B lymphocytes은 건강하고 죽상 경화증 발생하기 쉬운 생쥐 4 aortas 내에 존재한다. 또한 면역 세포는 atherogenesis이 조직의 중요한 역할을 제안 주변 대동맥 adventitia에서 찾을 수 있습니다. 2 얼마 동안, 면역 세포들이 활성화 상태 및 대동맥 벽 내의 세포 성분의 다른 유형의 양적 감지 죽상 경화증의 연구에 대한 RT - PCR과 immunohistochemical 방법으로 제한되었다. 몇 가지 시도는 인간의 aortas를 사용하여 유동세포계측법을 수행하기 위해 만들어진, 그리고 높은 autofluorescence 같은 문제의 숫자가 5,6를보고되었습니다. 인간 atherosclerotic plaques는 collagenase 1 소화했고, 무료로 세포는 CD14에 대한 수집 및 스테인드되었습니다 + / CD11c + 대식 세포 - 파생 거품 세포를 강조합니다. 본 연구에서는, &quot;모의&quot;채널은 거짓 - 긍정적인 얼룩을 방지하는 데 사용되었다. 소화 과정에서 축적 6 괴사성 물질 대동맥 표본에서 높은 autofluorescence를 생성 파편 많은 양의 상승을 제공합니다. 이 문제를 해결하려면, 부정과 긍정적인 컨트롤 패널이 제안되어 있으나, 이중 염색법는이 샘플에 적용 될 수 있습니다. 우리는 면역 세포 성분을 분석하고 활성화, 증식, 건강하고 죽상 경화증 발생하기 쉬운 대동맥에서 면역 세포의 분화를 특징하는 새로운 흐름 cytometry 기반의 방법 7을 개발했습니다. 이 방법은 대동맥 벽의 면역 세포 조성의 조사를 허용하고이 질병의 면역 측면의 조사에 대한 면역 방법의 광범위한 스펙트럼을 사용하는 가능성을 엽니다.

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Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

본 논문은 aortas의 면역 성분을 조사하기 위해 흐름 cytometry 기반 방법을 제공합니다. 신문은 또한 별도로 주변 adventitia 및 혈관 벽을 검사 수 있습니다 추​​가 기법을 보여줍니다. 이 방법은 대동맥 leukocytes의 phenotypical 분석을 수행하고 죽상 경화증 연구에 대한 몇 가지 면역 assays을 적용하는 가능성을 엽니다.

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.4K 조회수.  Eastern Virginia Medical School. 본 논문은 aortas의 면역 성분을 조사하기 위해 흐름 cytometry 기반 방법을 제공합니다. 신문은 또한 별도로 주변 adventitia 및 혈관 벽을 검사 수 있습니다 추​​가 기법을 보여줍니다. 이 방법은 대동맥 leukocytes의 phenotypical 분석을 수행하고 죽상 경화증 연구에 대한 몇 가지 면역 assays을 적용하는 가능성을 엽니다.

비디오: Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

연구

면역학 및 감염병학

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are widely used as a convenient cell system for analyzing SAMHD1 activity due to a low level of SAMHD1 RNA expression, leading to undetectable endogenous protein expression. Based on similar assays developed in the Stoye laboratory to characterize other retroviral restriction factors, the Bishop lab developed a two-color restriction assay to analyze SAMHD1 in U937 cells. Murine Leukaemia Virus-like particles expressing SAMHD1, alongside YFP expressed from an IRES, are used to transduce U937 cells. Cells are then treated with phorbol myristate acetate to induce differentiation to a quiescent phenotype. Following differentiation, cells are infected with HIV-1 virus-like particles expressing a fluorescent reporter. After 48 h, cells are harvested and analyzed by flow cytometry. The proportion of HIV-infected cells in the SAMHD1-expressing population is compared to that in internal control cells lacking SAMHD1. This comparison reveals a restriction ratio. SAMHD1 expression leads to a five-fold reduction in HIV infection, corresponding to a restriction ratio of 0.2. Our recent substitution of RFP for the original GFP as the reporter gene for HIV infection has facilitated flow cytometry analysis.
This assay has been successfully used to characterize the effect of amino acid substitutions on SAMHD1 restriction by transducing with viruses encoding altered SAMHD1 proteins, derived from site-directed mutagenesis of the expression vector. For example, the catalytic site substitutions HD206-7AA show a restriction phenotype of 1, indicating a loss of restriction activity. Equally, the susceptibility of different tester viruses can be determined. The assay can be further adapted to incorporate the effect of differentiation status, metabolic status, and SAMHD1 modifiers to better understand the relationship between SAMHD1, cell metabolic state, and viral restriction.

Described here is an established method to determine the extent of HIV-1 restriction by the cellular inhibitory protein SAMHD1. Human myeloid lineage U937 cells are transduced with a SAMHD1 expression vector co-expressing YFP, differentiated and then challenged with HIV-RFP. The level of restriction is determined by flow cytometry analysis.

인간 골수성 U937 세포에서 유세포 분석에 의한 SAMHD1 제한 분석

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...