이 프로토콜은 ACHI 모델을 사용하여 r-mTBI 투여 동물로부터 고품질 횡방향 해마 절편을 생산하기 위한 명확한 방법을 제공합니다. ACHI 모델은 경미한 부상을 입습니다. 두개골 골절이나 출혈, 개두술 또는 마취제 사용은 포함되지 않습니다.
또한 안정적인 전기생리학적 기록이 가능합니다. 이러한 기술을 통해 반복된 MTBI에 따른 시냅스 가소성의 변화를 조사할 수 있으며, 이에 대한 병인은 거의 알려지지 않았으며 치료 방법을 알릴 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 석사 과정 학생 인 Allyson Gross와 박사후 연구원 인 Dr.Eric Eyolfson이 될 것입니다.
쥐를 구속 원뿔에 넣고 주둥이와 콧구멍이 원뿔에 가깝도록 하여 적절한 환기를 허용하도록 합니다. 플라스틱 머리핀으로 꼬리 끝에서 닫힌 원뿔을 잡고 쥐의 움직임을 방지하십시오. 왼쪽 두정엽 위에 표적 디스크를 사용하여 구속된 쥐의 정중선 위에 헬멧을 수동으로 배치합니다.
다음으로, 임팩터를 확장 위치로 수동으로 설정하기 전에 쥐를 폼 패드에 올려 놓습니다. 임팩터 팁을 수동으로 내려 헬멧의 대상 디스크에 접촉합니다. 그런 다음 임팩터를 후퇴 위치로 설정하여 임팩터가 헬멧 위로 10mm 뒤로 물러나도록 합니다.
정위 암의 다이얼을 사용하여 임팩트 팁을 10mm 낮추어 헬멧의 타겟팅 디스크를 다시 만집니다. 그런 다음 임팩트 스위치를 뒤집어 동물의 머리가 초당 6미터로 10밀리미터 동안 빠르게 가속되도록 합니다. 장치가 활성화되면 즉시 구속 콘에서 동물을 제거하여 즉각적인 신경학적 평가 프로토콜(NAP)을 수행합니다.
마우스를 안락사시킨 후 뇌를 해부하여 거꾸로 된 페트리 접시에 젖은 여과지 위에 놓습니다. 날카로운 메스를 사용하여 소뇌와 전두엽 피질을 제거하여 뇌를 닦습니다. 뇌 정중선을 잘라내어 두 반구를 분리합니다.
가로 해마 슬라이스를 만들려면 한쪽 반구를 내측 표면에 놓고 메스를 안쪽으로 약 30도 기울인 다음 뇌의 등쪽 표면에서 얇은 슬라이스를 제거하여 피스톤에 장착할 평평한 표면을 제공합니다. 뇌를 등쪽 표면으로 뒤집고 마른 여과지에 뇌 조직을 부드럽게 두드려 과도한 ACSF를 제거합니다. 그런 다음 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 뇌의 등쪽 표면을 피스톤에 부착하고 복부 표면을 똑바로 세웁니다.
피스톤의 바깥 쪽 튜브를 뇌 위로 확장하고 뇌가 완전히 덮일 때까지 액체 아가로스를 튜브에 붓습니다. 피스톤 튜브 위에 냉각 블록을 고정하여 아가로스를 빠르게 응고시킵니다. 피스톤을 슬라이서의 챔버에 놓고 나사로 챔버를 고정합니다.
블레이드를 고정한 후 얼음처럼 차가운 산소 ACSF를 슬라이서 챔버에 추가합니다. 슬라이서에서 절단 속도를 4로, 진동을 6으로 설정하고 연속 단일 슬라이싱 스위치를 연속으로 전환합니다. 그런 다음 Start를 눌러 400마이크로미터에서 뇌 절편을 시작합니다.
슬라이서가 뇌를 절개할 때 직경이 큰 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 슬라이스를 산소가 공급된 ACSF의 회수조로 옮깁니다. 슬라이스를 섭씨 32도에서 30분 동안 회복시킨 다음 실온에서 추가로 30분 동안 회복되도록 둡니다. 이 단계를 반복하여 두 번째 반구에서 슬라이스를 만듭니다.
시중에서 판매되는 마이크로피펫 풀러를 사용하여 외경이 1.5mm이고 내경이 1.1mm인 10cm 붕규산 유리 모세관에서 1-2메가옴 기록 전극을 당깁니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 회복 수조에서 해마 절편을 카보겐화된 ACSF로 관류되고 섭씨 30도로 유지되는 챔버로 옮깁니다. 치상회와 과립 세포층이 시야에서 보이도록 뇌 조각의 방향을 지정합니다.
직립 현미경을 사용하여 경사 광학으로 치상회를 시각화합니다. 동심 양극성 자극 전극을 배치하여 분자층의 중간 1/3에 내측 천공 경로 또는 MPP 섬유를 활성화합니다. 그런 다음 ACSF로 채워진 유리 마이크로피펫을 MPP에 배치합니다.
조직을 만지면 섬유가 손상될 수 있으므로 전극을 더 멀리 떨어진 상태에서 시작하십시오. 자극 전극과 기록 전극이 배치되면 증폭기, 디지타이저 및 기록 소프트웨어를 사용하여 유발된 필드 응답을 시각화합니다. 전류 펄스로 조직을 자극하고 필드 EPSP보다 작은 투명 섬유 발리로 0.7 밀리 볼트의 최소 진폭을 보장하여 적합한 필드 흥분성 시냅스 후 전위 또는 필드 EPSP를 찾으십시오.
필드 EPSP가 최대 진폭의 70%가 될 때까지 시뮬레이션 강도를 높이고 설정합니다. 다음으로, 0.067Hz에서 전달되는 0.12밀리초 펄스로 20분 동안 안정적인 프리컨디셔닝 기준선을 설정합니다. 안정적인 슬라이스의 경우 fEPSP의 초기 기울기는 10% 변동성 미만이어야 하고 플롯된 필드 EPSP 기울기를 통과하는 최적 적합선의 기울기는 0.5 미만이어야 합니다.
paired-pulse 자극을 사용하고 자극/응답 입력/출력 곡선을 구성하여 기본 시냅스 특성의 변화를 결정합니다. 쌍 펄스 테스트의 경우, 0.033Hz에서 50밀리초의 인터펄스 간격으로 일련의 쌍을 이루는 펄스를 적용합니다. 입력/출력 곡선의 경우, 0.033Hz에서 0.0밀리초에서 0.24밀리초까지 일련의 증가하는 자극 강도를 적용하여 필드 EPSP 응답 크기 변화를 플로팅합니다.
주로 CB1 수용체의 활성화에 의존하는 장기 우울증을 연구하려면 10 헤르츠에서 6, 000 펄스를 사용하십시오. 사후 컨디셔닝 기록의 경우 0.067Hz의 주파수에서 0.12밀리초의 단일 펄스 자극을 사용하여 추가로 60분 동안 재개합니다. 사후 컨디셔닝 녹음 후, 쌍을 이루는 펄스 자극을 투여한 후 입력/출력 곡선을 관리합니다.
이를 기준선 기록과 비교하여 시냅스전 방출 특성의 관찰된 변화와 장기 기록을 위한 슬라이스의 상태를 평가합니다. 분석하는 동안 시냅스전 가소성 데이터 세트의 개별 조각에서 데이터 보존을 결정하기 위한 제외 기준을 준수합니다. 사전 컨디셔닝 베이스라인 동안 필드 EPSP 슬로프에 가장 적합한 선에 큰 기울기를 표시하는 슬라이스, 사전 컨디셔닝 베이스라인의 불안정성, 사후 조건 기간의 불안정성을 제외합니다.
기준선에서 신경학적 평가 프로토콜(NAP 점수)은 가짜 쥐와 반복된 mTBI 쥐 사이에 차이가 없는 것으로 나타났습니다. 깨어 있는 모든 폐쇄 머리 부상 세션 후, 반복되는 mTBI 쥐는 샴에 비해 NAP 작업 내에서 상당한 장애를 보였으며, 이는 미묘하지만 상당한 행동 결함이 발생했음을 나타냅니다. 일련의 쌍을 이룬 펄스가 투여되었고, 제2 필드 EPSP의 크기의 비율이 제1 필드 EPSP에 비해 계산되었다.
쌍 펄스 비율은 가짜 mTBI 쥐와 반복된 mTBI 쥐 간에 차이가 없었으며, 반복된 mTBI 쥐가 치아이랑에 대한 MPP 입력의 기본 시냅스 생리학을 변경하지 않았음을 보여줍니다. 장기 우울증을 유도하기 위해 10헤르츠 프로토콜을 투여했을 때, 부상 후 첫날에 장기 우울증을 유지하기 위해 치아이랑에 대한 MPP 입력 용량이 일시적이지만 유의하게 감소했습니다. 그러나, 부상 후 7일째까지, 가짜 및 반복된 mTBI 동물의 조각은 동등한 장기 우울증을 나타내었지만, 반복적인 mTBI 동물이 장기 우울증의 증가를 나타내는 약간의 경향이 있음을 나타냈다.
해부 및 절단 과정을 미리 계획하는 것은 실행 가능한 해마 절편을 성공적으로 만들고 안정적인 전기생리학적 기록을 얻는 데 중요합니다. 이 절차는 TBI 병태생리학을 검사하고 새로운 치료 방법을 개발하는 데 사용할 수 있는 안정적인 실험 플랫폼을 만듭니다. 뇌를 제거하는 것에서 횡 해마 슬라이스를 위해 압축 필름을 절단하도록 배치하는 것까지의 움직임은 치애 이랑에 전극을 정확하게 배치하는 것과 마찬가지로 중요합니다.
