이 프로토콜은 양식 어종에서 단일 세포 수준 연구를 용이하게 하기 위해 나일 틸라피아 장에서 고품질 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 신뢰할 수 있는 참조를 제공합니다. 이 기술은 매우 효율적이며 대부분의 실험실 조건에서 구현할 수 있습니다. 양식 어종에 대한 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 추가 시험의 필요성을 줄입니다.
6개월 된 나일 틸라피아 물고기를 잘 통기된 멸균수에서 15분 동안 헹구어 표면에서 느슨하게 결합된 박테리아를 씻어내는 것으로 시작합니다. 효소 세포 해리 시약을 제조하기 위해, PBS 중의 콜라게나제 디파아제를 밀리리터당 1밀리그램의 최종 농도로 희석한다. 준비된 효소 용액의 95% 부피와 FBS의 5% 부피를 혼합합니다.
그런 다음 사용하기 전에 원심 분리기를 섭씨 4도까지 미리 냉각하십시오. 조직 해부를 위해 안락사 된 물고기를 얼음 위에 놓고 내장 중간 부분의 3-4 센티미터를 수집합니다. 집게를 사용하여 지방과 장간막을 절제하십시오.
장 표면에 붙어있는 지방과 탄력 있고 가단성 있는 맑은 점막을 제거합니다. 주사기를 사용하여 멸균 된 얼음처럼 차가운 PBS로 장 조각을 부드럽게 헹구어 장 내용물과 점액을 씻어냅니다. 여러 번 세척한 후 조각을 작은 조각으로 해부하고 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다.
혼합물을 섭씨 4도에서 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그리고 상청액을 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 0.08% BSA-DPBS로 교체합니다. 유리 피펫을 사용하여 부드럽게 흡인하여 조직 조각을 재현탁합니다.
조각을 한 번 더 세척 한 후, 상청액을 제거하고 준비된 효소 해리 시약 1 밀리리터를 첨가한다. 또한 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위해 5마이크로리터의 RNA 억제제를 해리 시약과 혼합합니다. 튜브를 섭씨 37도의 강화 수조에 놓고 30-60분의 배양 시간 동안 5분마다 튜브를 수동으로 뒤집습니다.
튜브가 회전되면 광경 팁을 사용하여 효소 세포 해리 시약을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 0.08% BSA-DPBS 1밀리리터를 넣고 세포 파괴를 방지하기 위해 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 세포를 한 번 더 원심 주입하고 재현탁한 후 0.08% BSA-DPBS로 미리 적신 40마이크로미터 셀 스트레이너를 50밀리리터 원뿔형 튜브에 놓습니다.
스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과시킵니다. 스트레이너를 두드린 다음 200마이크로리터 DPBS로 헹구고 튜브 바닥에 서스펜션을 모으십시오. 현탁액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴 후, 5 마이크로 리터의 DNA를 첨가하고 섭씨 15도에서 20 분 동안 현탁액을 배양한다.
원심분리가 완료되면 상층액을 제거하고 칼슘 및 마그네슘 이온이 없는 400마이크로리터의 얼음처럼 차가운 DPBS에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 넓은 구멍 팁으로 위아래로 부드럽게 피펫하여 세포를 혼합하고 이 과정을 한 번 더 반복합니다. 염색을 위해 세포 현탁액을 0.4% 트리판 블루 용액에 동일한 비율로 혼합하고 실온에서 3분 동안 배양합니다.
그런 다음 유리 슬라이드에 혼합물 10 마이크로 리터를 첨가하십시오. 현미경으로 생존 세포와 죽은 세포를 세 가지 필드로 계산하고 세포 생존율을 계산합니다.tage. 일반적으로 사용되는 몇 가지 효소의 해리 효율을 비교했습니다.
콜라게나제 디스파아제 혼합물은 콜라게나제 디스파제 또는 트립신 단독 및 기타 여러 효소 혼합물보다 더 나은 해리 효과를 갖는 것으로 확인되었습니다. 현미경 검사 결과 장 세포는 생존력이 높고 단일 세포로 분산되어 있는 것으로 나타났습니다. 대부분의 세포는 생존 가능했지만 일부는 투과된 세포막 때문에 염색되어 죽었습니다.
사용되는 PBS의 유형에주의하십시오. 효소 분해 용액은 효소가 효과적으로 기능하기 위해 칼슘/마그네슘 이온이 필요하기 때문에 칼슘/마그네슘이 없는 PBS와 함께 사용할 수 없습니다. 이 절차는 양식 어종에 대한 단일 세포 수준 연구를 용이하게 하여 양식 어종의 세포 해리 프로토콜을 개발하는 데 유용한 참고 자료를 제공합니다.
