모두를 환영합니다. 내 이름은 승리 수라체퐁입니다. 저는 태국 카셋스타트 대학의 수의학 및 면역학 학부 조교수입니다.
저와 제 팀은 틸라피아에서 새로운 바이러스 성 질병을 전문으로하고 있습니다. 우리는 지금 틸라피아에서 높은 사망을 일으키는 틸라피아 호수 바이러스에 일하고 있습니다. 틸라피아는 전 세계적으로 두 번째로 중요한 어종이기 때문에 백만 명에게 단백질 공급원을 제공하고 식량 안보에 중요한 역할을 합니다.
그래서 틸라피아 호수 바이러스의 최근 발발은 많은 과학자들이이 문제에 대한 해결책을 찾기 위해 노력하도록 유도 사회 경제적 영향을 야기. 지금까지 우리는 바이러스를 검출하기 위해 매우 민감하고 빠르며 정확한 방법이 필요합니다. 이 비디오에서는 샘플 수집, 샘플 인구 및 실시간 PCR 분석에서 시작하여 물고기 조직에서 틸라피아 호수 바이러스를 감지하는 단계별로 보여줍니다.
첫째, 물고기를 안락사시키기 위해 물에 천 오일의 과다 복용을 용해합니다. 죽은 물고기를 트레이에 놓고 95%에탄올을 사용하여 장비를 소독한 다음 알코올 버너로 태워버로 태워버를 타십시오. 천천히 간을 수집하기 위해, 위쪽으로 낮은 복부에서 물고기를 엽니 다 잘라.
간 부분을 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 수집합니다. RNA 추출의 첫 번째 부분은 라미나르 플로우 후드에서 수행되어야하며 보호 장비를 착용해야합니다. RNA 추출 시약 1밀리리터를 튜브에 넣습니다.
조직 페일을 사용하여 간을 균질성으로 분쇄합니다. 튜브에 200 마이크로리터의 클로로폼을 넣습니다. 그런 다음 튜브를 여러 번 반전시켜 부드럽게 섞습니다.
실온에서 3분간 따로 둡니다. 12, 000 RCF에서 섭씨 4도에서 원심분리기는 15분 동안. 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 수집합니다.
무색 위 수성 상의 500 마이크로리터를 새로운 튜브로 부드럽게 옮기십시오. 튜브에 이소프로판놀 의 한 볼륨을 추가합니다. RNA를 침전시키기 위해 2 시간 또는 하룻밤까지 영하 20도에서 가열하십시오.
인큐베이션 후 동일한 원심분리기 상태에서 용액을 원심분리합니다. 원심분리기에서 튜브를 수집한 다음 상체를 폐기하십시오. RNA 펠릿은 화살표에 의해 뾰족한 것으로 볼 수 있다.
RNA 펠릿을 세척하고 여러 번 반전하기 위해 튜브에 75 %의 에탄올 1 밀리리터를 추가합니다. 섭씨 4도, 10, 000 RCF에서 15분 동안 원심분리기. 원심분리기에서 튜브를 수집한 다음 상체를 폐기하십시오.
자동 파이프를 사용하여 남은 에탄올을 꺼내고 실온에서 5~10분 동안 공기 건조를 드립니다. RNA 펠릿을 용해시키기 위해 섭씨 55~60도까지 미리 데워진 30~60마이크로리터 RNase 프리 워터를 추가합니다. RNA 용액의 1~ 2마이크로리터를 사용하여 마이크로 볼륨 분광계를 사용하여 농도를 측정합니다.
결과는 화면에 표시됩니다. RNase 무료 물을 사용하여 마이크로리터 당 200 나노그램으로 농도를 희석시킵니다. 다음과 같이 나열된 화학 물질 및 조건을 사용하여 cDNA 합성을 수행하십시오.
열순환기를 사용하여 RNA를 제안된 조건으로 cDNA로 변환합니다. 다음은 실시간 PCR을 사용하여 TiLV 부하를 결정하는 데 사용되는 화학 물질 및 조건입니다. qPCR 마스터 믹스6밀리리터를 흰색 qPCR 스트립 튜브의 각 바이알에 분배합니다.
그 후, cDNA 샘플의 4밀리리터가 우물에 적재된다. 이 단계에서 는 샘플에서 샘플로의 오염을 피하기 위해 모든 우물에서 새 파이프 팁을 변경해야합니다. 투명 qPCR 스트립 캡으로 qPCR 스트립을 단단히 밀봉하십시오.
스트립 끝에서 가볍게 움직여 용액을 부드럽게 섞습니다. 그런 다음 마이크로 원심 분리기를 사용하여 아래로 회전하여 혈관 의 바닥에있는 모든 액체를 수집합니다. 비디오에 표시된 대로 두 단계 조건을 사용하여 사용할 96 웰 플레이트에서 우물을 선택합니다.
염료를 위한 식물로 사이버 녹색을 선택합니다. 알 수 없는 것을 샘플 유형으로 선택하고 샘플 이름 상자에 이름을 삽입합니다. 실시간 PCR 기계의 뚜껑을 열고 qPCR 스트립을 할당된 양에 배치합니다.
그런 다음 뚜껑을 닫습니다. 선택한 조건으로 컴퓨터를 실행합니다. 뚜껑이 원하는 온도에 도달한 후 기기가 시작하고 실행됩니다.
qPCR 조건이 끝나면 증폭 곡선이 표시됩니다. 여기서 속도 화살표는 임계값 수준이 지수 단계와 선형 단계 사이에 끊어지는 위치를 지적하여 CT 값을 생성합니다. 그런 다음 CT 값을 바이러스 로그 카피 번호로 추정하여 표준 곡선을 사용하여 남아 있는 여러 바이러스를 계산합니다.
녹는 피크는 또한 qPCR에 의해 검출된 바이러스가 실제로, 용융 피크가 일반적으로 섭씨 79.5도에서 80.5도 사이인 TiLV인지 여부를 확인하기 위하여 표시됩니다. 그래서 우리는이 방법이 제어를 구현하고 TiLV 감염의 확산을 제한 할 수 있습니다 전 세계의 농민과 조직에 대한 중요한 도구가 될 수 있기를 바랍니다.
