콜러스 생산을 위한 절제로서의 젊은 꽃피는 신속하고 효율적인 유전자 변환및 유전자 기능을 드러내는 재생 방법과 작물 개선을 위한 재생 방법을 확립하는 데 중요합니다. 콜러스 생산을 위한 절제로서 젊은 꽃피는 신속하고 효율적인 유전자 변환 및 유전자 기능을 드러내기 위한 재생 방법을 확립하는 데 중요합니다. 이 기술의 비디오 데모는 시청자가 시간과 노력을 낭비하지 않고 원하는 형질 전환기를 생성하는 재료를 유지하는 과정을 이해하는 데 도움이됩니다.
논에서 어린 쌀 꽃집이나 메이오시스 단계에서 온실을 수집하여 잎 칼집으로 덮여 있는지 확인하십시오. 70%의 알코올 면봉으로 각 꽃집을 닦고 절단하기 전에 건조시키십시오. 멸균 실험실 벤치에 꽃집을 가져와 멸균 된 가위로 잘라낸 다음 절단을 NBD2 배지가 들어있는 페트리 플레이트로 옮길 수 있습니다.
10~14일 동안 26°C에서 어둠 속에서 접시를 배양하여 콜러스를 유도합니다. 변환을 수행하기 위해, 50 밀리리터 원추형 멸균 시험관에서 동일한 항생제를 함유하는 액체 YEB 배지의 5밀리리터로 선택적 항생제를 가진 백색 EB 플레이트에서 단일 콜로니를 이송한다. 박테리아가 0.5의 OD 600로 성장할 때까지 250 배 g와 25 ~ 28섭씨에서 궤도 셰이커에 튜브를 흔들어.
250 밀리리터 원뿔형 플라스크에 동일한 선택적 항생제를 가진 YEB 배지 의 100 밀리리터에 세균 현탁액 1 밀리리터를 추가하고 4 시간 동안 250 배 g및 28 섭씨에서 궤도 셰이커에 플라스크를 흔들어 줍니다. 원심분리기는 박테리아를 수집하기 위해 실온에서 10분 동안 4, 000g에서 배양한다. 상체를 버리고 AAM AS 매체로 펠릿을 다시 중단한 다음 서스펜션을 0.4의 OD 600으로 희석시 보디울 수 있습니다.
인큐베이션 후, 약 150밀리리터 멸균 플라스크로 약 150개의 건강한 밝은 황색 배아 원내 캘리를 수집합니다. 플라스크에 세균세포 현탁액50~75밀리리터를 추가한 다음 신선한 AAM AS 배지 10~25밀리리터를 추가하여 10~20분 동안 칼리를 담그고 가끔 씩 씩씩하게 흔들어줍니다. 플라스크에서 세균 현탁액을 조심스럽게 붓고 멸균 필터 용지로 칼리를 말린 다음 NBD AS 매체로 페트리 접시에 놓고 필터 용지로 덮습니다.
3 일 동안 어둠 속에서 25 ~ 28도의 칼리를 배양하여 세균 성 과성장을 확인합니다. 3일간의 공동 재배 후, 필터 용지를 사용하여 멸균 페트리 접시에 칼리를 옮은 다음 깨끗한 벤치에서 2 시간 동안 공기를 건조시하십시오. calli가 필터 용지에 부착되지 않았는지 확인하고 기본 선택 매체 NBD2로 전송합니다.
2 주 후, 신선한 선택 매체를 포함하는 새로운 플레이트에 캘리를 균등하게 전송한 다음, 분화를 위해 신선한 MS 매체로 칼리를 이동하고 촬영 싹을 1리터 히그로마이신 당 10 밀리그램으로 MS 매체로 이동하여 더 많은 촬영을 증식합니다. 새로운 싹을 반 MS 매체로 옮겨 뿌리 유도를 위해 25~28도의 빛 아래에서 배양합니다. 변형 된 식물은 2 주 이내에 뿌리를 생산해야합니다.
생식 표현형 관찰을 수행하려면, 플로리다에서 팔레아와 lemma를 제거하고 스테레오 현미경으로 전체 anthers를 이미지. 꽃가루 생존가능성을 관찰하려면 꽃무늬 가무늬 가루 전에 성숙한 쌀 스파이크를 선택하고 창백한 과 뢰마를 제거하여 마취기를 방출합니다. 여섯 개의 anther를 가지고 유리 슬라이드에 놓습니다.
증류수 한 방울을 넣고 핀셋으로 앤터를 분쇄하여 꽃가루 곡물을 풀어주린 다음, 2~3방울의 요오드 용액을 넣고 커버슬립으로 덮습니다. 낮은 배율 현미경에서 슬라이드를 관찰하십시오. 검은 색으로 염색 된 꽃가루 곡물은 더 활발한 생존력을 나타내며 색상이 없거나 염색 된 노란색 갈색이 있는 곡물은 기절하거나 퇴화됩니다.
횡단 면방향 현미경 검사를 수행하려면 0.5%의 toluidine 블루 용액을 사용하여 슬라이드를 30 분 동안 묻은 다음 물로 헹구고 연기 후드에서 건조하십시오. 일단 건조되면, 중립 나무 접착제로 슬라이드를 밀봉 부드럽게 슬라이드에 커버 슬립을 배치하고 연기 후드에 건조, 다음 현미경에서 샘플을 이미지. 이 프로토콜은 쌀에 있는 Agrobacterium 매개 유전 변환에 의해 남성 멸균 선을 만드는 데 사용되었다.
배아원 캘리는 추가 감염을 위해 더 많은 calli를 얻기 위하여 증식을 위한 변환 또는 하위 배양을 위해 직접 이용되었습니다. 48시간 동안 공동 육성한 후, 칼리는 2라운드 선발 매체로 이동했다. 10~14일 후, 변형된 칼리는 새롭게 형성된 마이크로칼리를 보였고, 트랜스포메이션되지 않은 칼리는 갈색으로 변해 죽었다.
나중에, 건강하고 크리미한 색깔의 칼리는 재생 매체로 옮겨졌습니다. 변형된 칼리는 점차 녹색 반점을 보였다. 이러한 녹색 반점은 재생 매체에서 배양되어 촬영 성장을 허용한 다음 뿌리를 유도하기 위해 절반 MS 매체로 이동하였다.
나중에, 잘 발달 된 뿌리와 건강하고 활발한 성장 싹을 수확했다. 총 21마리의 재생된 묘목을 얻었다. Hygromycin 영역에 대한 PCR 증폭은 변환 주파수가 약 85.71%였으며 변압제는 sgRNA 표적 부위에서 돌연변이를 식별하기 위해 유전자형이 되었다.
18개의 형질화 식물 중 8개의 이종수구와 3개의 동질성 라인은 CRISPR CAS9 양성이었다. 동종 구스 녹아웃 돌연변이는 기본적인 남성 생식 기관 관찰에 의해 검증되었다. osabcg15의 anthers는 야생 유형의 것보다 작고 창백했으며 성숙한 꽃가루 곡물이 부족했습니다.
횡단 단면 현미경 검사는 osabcg15에서 개미 형태 학적 결함을 조사하기 위해 수행되었다. 10단계에서 야생형 마이크로포기는 둥근 모양으로 되어 진한 파란색 의 색소로 얼룩진 엑신으로 비우게 되었습니다. 대조적으로, osabcg15 마이크로포자는 붕괴되고 저하되었습니다.
이 프로토콜을 시도할 때 수집된 물질이 음오사증 단계에 있는지 확인하고 칼리의 공기 건조 시간을 제어하는 것이 중요합니다.
