연구자 작업을 지원하는 펠로우십을 제공한 움베르토 베로네시 재단(Umberto Veronesi Foundation)에 감사드립니다.

1. 기본 3D 재구성 장 점막 모델 준비
알림: 전체 절차는 멸균 층류 후드에서 수행해야 합니다. 세포 인큐베이터 사용과 관련된 절차의 모든 단계는 배양액이 5%CO2 를 함유한 가습 분위기에서 37°C에서 배양됨을 의미합니다(프로토콜에 달리 명시되지 않는 한).
<ol><li>장 모델 시스템에 사용되는 세포주의 사전 준비<ol><li>F25 플라스크에 2mM L-글루타민, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)을 함유한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 5mL에 5 x 105 농도의 L929 마우스 섬유아세포 세포를 종자하고 장 모델 제작 4일 전에 인큐베이터에서 배양합니다. 48시간 후 피펫을 사용하여 배지를 제거합니다. 그런 다음 신선한 배지(5mL)를 넣고 세포를 48시간 동안 더 배양합니다. 알림: 셀은 사용하기 전에 80% 합류해야 합니다.</li>
		<li>F75 세포 플라스크에 10mL의 DMEM 배지(10% FBS 및 1% Pen-Strep 포함)에 Caco-2 세포(2 x 106 농도)를 종자하고 장 점막 모델 구축 4일 전에 인큐베이터에서 배양합니다. 48시간 후 1.1.1단계에 설명된 대로 배지를 변경하고 48시간 동안 80%의 밀도로 추가로 배양합니다. 알림: 세포는 활성 증식 단계에 있어야 합니다: 너무 희박하지도 너무 합류하지도 않아야 합니다. 50-60% 합류가 권장됩니다. 모델을 만들기 전날에는 세포를 파종해서는 안 되는데, 이는 세포의 증식 능력을 늦출 수 있기 때문이며, 이는 재구성된 3D 모델에 완벽하게 뿌리를 내리지 못할 수 있기 때문입니다.</li>
		<li>현탁액(농도 1 x 106)에서 자라는 U937 세포를 10mL의 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지(2mM L-글루타민, 1% 피루브산나트륨, 1% FBS 및 1% Pen-Strep 포함)에 75 mL를 추가하고 모델 설정 2일 전에 인큐베이터에 48시간 동안 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Transwell 공동 배양 플레이트 인서트 준비<ol><li>0.4μm 필터가 있는 인서트가 포함된 24웰 플레이트를 선택합니다. 참고: 0.4μm 필터는 약물 수송 연구에서 표준 선택입니다. 3μm 및 8μm 필터 크기는 콜라겐 포매 세포의 손실을 방지하기 위해 권장되지 않습니다.</li>
		<li>피펫을 사용하여 필터 인서트 아래 및 위에 500μL의 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)으로 Transwell 필터(이하 멤브레인 인서트라고 함)를 수화합니다.</li>
		<li>멀티웰 플레이트를 닫고 최소 2시간 동안 인큐베이터에 넣습니다. 알림: 멤브레인 인서트는 최대 24시간 동안 HBSS에 남아 있을 수 있습니다. 이 작업은 모델을 구성하기 전날에 수행할 수 있습니다. 멤브레인 인서트가 완전히 수화되고 필터가 건조되지 않는 것이 중요한데, 이는 샘플이 제대로 부착되기 어렵게 만들 수 있기 때문입니다.</li>
		<li>2시간(또는 24시간) 후에 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 피펫을 사용하여 멤브레인 삽입물 위와 아래에서 HBSS를 조심스럽게 흡입하고 10분 동안 건조시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>기본 3D 장 모델 시스템의 cell-free collagen lamina propria 제조 (DAY 1)<ol><li>DMEM에 10% 소 태아 혈청(FBS), 200mM L-글루타민, 1% 중탄산나트륨 및 1.35mg/mL 유형 1 쥐꼬리 콜라겐 성분이 포함된 얼음 위의 50mL 멸균 튜브에 무세포 콜라겐 용액을 준비합니다. 참고: 이러한 모든 구성품은 얼음 위에 보관하고 냉각된 피펫 팁과 함께 DMEM에 추가해야 합니다. 유형 1 쥐 꼬리 교원질은 이것이 증가 온도 및 PH로 중합되기 때문에 마지막에 추가되어야 합니다. 준비된 cell-free collagen 용액의 양은 필요한 장내 등가물의 수에 따라 달라집니다.</li>
		<li>250μL의 용액을 각 플레이트 인서트(멤브레인 필터 위)에 추가하여 선택한 장내 등가물 수만큼 늘리고 멀티웰 플레이트 위에 뚜껑을 놓습니다. 콜라겐 용액이 층류 후드 아래의 실온(RT)에서 중합되도록 합니다. 참고: 보다 고체상으로의 전환 외에도 중합은 노란색에서 분홍색으로의 색상 변화에서도 분명합니다. 중합은 일반적으로 10-15분 이내에 완료됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>섬유아세포(L929) 및 단핵구(U937) 세포의 준비, 세포 계수 및 모델 시스템에 추가(DAY 1)<ol><li>인큐베이터에서 L929 세포 배양(1.1.1단계)을 제거합니다. 진공 펌프를 사용하여 배지를 흡입하고 5mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS, Ca 및 Mg 제외)로 교체하고 세포를 헹굽니다.</li>
		<li>진공 펌프를 사용하여 PBS를 흡입합니다. 미리 준비된 트립신-EDTA 용액 2mL(PBS의 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA)를 넣고 인큐베이터에 3-5분 동안 넣습니다.</li>
		<li>도립 현미경(예: Eclipse Ts2, Nikon)을 사용하여 세포가 접착 표면에서 분리되는지 여부를 확인합니다. 이 경우 즉시 2mL의 DMEM(10% FBS 함유)을 추가하여 트립신 반응을 차단하고 세포를 헹굽니다.</li>
		<li>세포 용액을 멸균 15mL 튜브에 옮기고 645 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 진공 펌프를 사용하여 상층액을 흡입합니다. 알림: 펠릿을 방해하지 않도록 주의해야 합니다. DMEM의 효과는 L929 및 U937 세포에서 테스트되었으며 성장에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다.</li>
		<li>펠릿에 DMEM 1mL를 추가하고 세포를 현탁시킵니다. 알림: 세포는 용액에 균질하게 부유해야 합니다.</li>
		<li>DMEM에서 세포 20μL를 제거하고 트리판 블루 용액 20μL를 추가합니다. 혼합물 20μL를 제거하고 세포 계수 챔버를 사용하여 세포 밀도를 현미경으로 평가합니다.</li>
		<li>인큐베이터에서 U937 세포 배양(1.1.3단계)을 제거합니다. 세포 용액을 645 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 진공 펌프를 사용하여 펠릿을 방해하지 않도록 상층액을 흡입합니다.</li>
		<li>세포를 1mL의 RPMI에 현탁시킵니다. L929 세포와 마찬가지로 세포가 용액에 균질하게 부유하는지 확인하십시오.</li>
		<li>마찬가지로, 1.4.6단계에서 보고한 대로 셀 밀도를 설정합니다.</li>
		<li>1.3.1 단계에서 설명한대로 콜라겐 용액을 준비합니다. 알림: 만들 용액의 양은 각 인서트(또는 모델)에 대해 450μL를 고려해야 합니다.</li>
		<li>구성할 각 장 등가 모델에 대해 50μL의 부피에 각각 50,000개의 L929 세포 및 15,000개의 U937 세포를 포함하는 DMEM 용액을 준비합니다. 참고: 셀 수는 중요한 요소입니다. 두 가지 세포 유형이 너무 많으면 적절하게 조직되지 않은 세포로 과도하게 가득 찬 판막이 생성됩니다. 섬유아세포(콜라겐 생성)의 수가 적으면 박판(lamina propria)이 덜 조밀해지는 반면, 단핵구가 너무 적으면 자극에 대한 면역 반응을 방해합니다. 각 50μL 부분 표본 내에 정확한 수의 세포가 존재하는 경우 각 24웰 플레이트에 있는 12개의 필터 삽입물에 대해 총 600μL의 부피를 준비할 수 있습니다.</li>
		<li>1.4.10단계에서 세포를 포함하는 각 50μL 부분 표본을 450μL의 콜라겐 용액에 추가합니다. 잘 섞는다.</li>
		<li>각 모델에 대해 500μL의 콜라겐 함유 세포 용액으로 사전 코팅된 cell-free collagen lamina propria를 오버레이합니다. 참고: 각 삽입물에 볼륨을 빠르게 추가하는 것이 중요하므로 재건된 장 점막 모델의 수를 한 번에 12개 이하로 제한하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>플레이트를 닫고 용액이 굳을 수 있도록 인큐베이터에 2시간 동안 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>준비, 세포 계수 및 장 모델에 상피 Caco-2 세포 추가(DAY 1)<ol><li>인큐베이터에서 Caco-2 세포 배양(단계 1.1.2)을 제거합니다. 예비 헹굼을 위해 10mL의 PBS를 사용하여 1.4.1단계의 절차를 반복합니다. 그런 다음 미리 준비된 트립신-EDTA 용액 5mL(Ca- 및 Mg-free PBS의 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA)를 넣고 인큐베이터에 5-8분 동안 넣습니다.</li>
		<li>1.4.3단계(트립신 반응을 차단하기 위해 5mL의 DMEM 사용)를 1.4.6단계까지 반복하여 세포 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.</li>
		<li>50μL에 150,000개의 Caco-2 세포를 포함하는 DMEM 용액을 준비합니다. 알림: 사용된 셀의 수는 임계점입니다. 150,000개의 세포를 초과하면 조밀하고 무질서한 상피층이 형성될 수 있는 반면, 100,000개 미만으로 너무 적으면 세포가 성장하기 어렵고 기저막을 적절하게 덮지 못하여 불연속적인 장 상피층을 형성합니다. 셀이 효과적으로 일시 중단되었는지 확인합니다. 200 μL 피펫의 팁은 균일한 분포를 보장하는 데 사용할 수 있습니다. 주어진 시간에 12개의 모델을 구성할 수 있다는 점을 감안할 때 600μL 셀 용액을 준비할 수 있습니다.</li>
		<li>단계 1.4.14에서 요구되는 2시간 후, DMEM에 현탁된 Caco-2 세포 50μL를 각 기저막의 중간에 추가합니다. 멀티웰 플레이트의 뚜껑을 닫습니다.</li>
		<li>멸균 층류 후드 아래에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 30분 동안 인큐베이터로 옮깁니다.</li>
		<li>10% FBS 및 1% Pen/Strep가 포함된 DMEM 용액을 준비합니다. 참고: 모델당 1mL 용량을 사용할 수 있는 충분한 용액을 준비합니다.</li>
		<li>재구성된 모델 위에 500μL의 배지를 추가하고 필터 아래에 500μL를 추가합니다. 알림: 필터 위에 매체를 추가할 때 셀이 분리되거나 스트레스를 받지 않도록 주의해야 합니다.</li>
		<li>멀티웰 플레이트 시스템을 닫고 인큐베이터에 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>모델 준비/형성 및 사용(DAY 2 - DAY 6)<ol><li>2일차: 피펫을 사용하여 재구성된 모델 위와 필터 아래 모두에서 용액을 조심스럽게 제거합니다. 필터 위와 아래에 각각 500μL의 신선한 DMEM(10% FBS 및 1% Pen/Strep)으로 교체합니다.</li>
		<li>3일차: 1.6.1단계에서 위와 같이 반복합니다.</li>
		<li>4일차: 1.6.1단계에서 위와 같이 반복합니다. 참고: 이 장 모델은 정적 세포 모델입니다. 따라서 분자의 방출과 세포의 성장 및 자극을 촉진하기 위해서는 매일 배지를 바꾸는 것이 매우 중요합니다.</li>
		<li>5일차: 이 시점에서 모델이 완전히 형성/개발되었습니다. 추가 연구를 위해 이러한 모델을 사용하십시오. 알림: 모델을 사용하기에 가장 좋은 시기는 5일입니다. 세포는 인큐베이터에서 더 오랜 기간 동안 유지될 수 있지만 시간이 지날수록 상피 세포가 통제되지 않은 방식으로 성장할 가능성이 커져 사용하기 어려운 조직화되지 않고 조밀한 층이 될 수 있습니다.</li>
		<li>5일째 되는 시점에 독성(글루텐 또는 지질다당류[LPS]) 또는 관심 있는 유익한 성분(폴리페놀)으로 모델을 배양합니다. DMEM 매체에 매달린 재구성된 모델의 상단 부분에 추가합니다. 참고: 관심 있는 각 성분의 적절한 농도를 계산하고 DMEM 배지에 현탁해야 합니다. DMEM 배지만 포함하는 처리되지 않은 대조군은 실험 모델과 비교하기 위해 설정해야 합니다.</li>
		<li>대조군 및 실험 모델을 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>6일차: 피펫으로 필터 위와 아래의 매체를 제거합니다. 참고: 이 배지는 염증성 사이토카인의 방출을 측정하기 위한 후속 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 유형 테스트를 위해 보관할 수 있습니다. 이를 위해 배지를 멸균 바이알에 첨가하고 추가 분석을 위해 -20°C에서 보관해야 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 재건된 장 점막 모델의 파라핀 임베딩
알림: 전체 절차는 화학 흄 후드 아래에서 수행해야 합니다. 각 단계와 해당 시간 할당은 엄격하게 준수되어야 합니다. 이러한 이유로 모든 시약을 미리 준비하는 것이 중요합니다.
<ol><li>파라핀 기계를 사용할 수 있도록 58°C로 설정합니다.</li>
	<li>멤브레인 인서트를 옮겨 멸균 24웰 플레이트에서 플라이어를 사용하여 웰을 청소합니다.</li>
	<li>필터 위의 PBS에 500μL의 37% 완충 포르말린을 추가하고 필터 아래에 1mL를 추가합니다. 뚜껑을 닫고 상온에서 2시간 동안 화학 흄 후드 아래에 그대로 둡니다. 참고: 대안으로 4% 완충 포르말린을 RT에서 1시간 동안 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>포르말린을 제거하고 필터 위와 아래에 HBSS 용액을 추가합니다. 그런 다음 HBSS를 제거합니다.</li>
	<li>멤브레인 인서트에서 lamina propria를 분리합니다. 참고: 장 점막의 세포는 일반적으로 막 삽입물에 부착되지 않기 때문에 매우 쉽게 분리됩니다. 또한 두 개의 시료 격실(정점 및 기저)은 부착된 상태로 유지되어 3D 구조를 유지합니다. 어떤 이유로 쉽게 분리되지 않으면 멸균 일회용 메스 블레이드를 사용하여 멤브레인 삽입물에서 장 점막을 제거하는 것이 중요합니다. 멤브레인 인서트를 절단하여 플라스틱에서 분리할 수 있습니다. 샘플을 메스로 만지지 않도록 주의하십시오. 콜라겐이 포집된 세포에서 멤브레인 삽입물을 제거하는 이유는 이 필터가 후속 고정 또는 파라핀 포매 단계에서 분리되어 장 점막 모델 간의 비교가 불균형해질 수 있기 때문입니다. 더욱이, 매립된 단면 내의 멤브레인 삽입물은 절편을 방해할 수 있는 다른 일관성을 가지고 있습니다.</li>
	<li>100mL 비커를 화학 흄 후드 아래에 놓고 각각 조사 중인 하나의 재건된 장 점막 모델 시스템을 포함하도록 올바르게 라벨링합니다. 각 비커에 35% ETOH 25mL를 첨가한 다음 재건된 장 점막을 추가합니다. 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>35% 에탄올을 50% 에탄올 25mL로 교체하고 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>50% 에탄올을 70% 에탄올 25mL로 교체하고 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>70% 에탄올을 25mL의 80% 에탄올로 교체하고 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>80% 에탄올을 25mL의 95% 에탄올로 교체하고 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>95% 에탄올을 100% 에탄올 25mL로 교체하고 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>100% 에탄올을 100% 에탄올의 또 다른 25mL 변화로 교체하고 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>흄 후드 아래에 100mL 비커를 놓고 각각 조사 중인 모델 하나를 포함하도록 올바르게 라벨을 붙입니다. 50mL의 크실렌 또는 조직학적 투명화제를 10-20분 동안 추가합니다. 참고: Histo-Clear(조직학적 투명화제)는 친산성 염색제의 투명도와 생동감을 향상시키기 때문에 권장됩니다. 투명화 시간은 재건된 장 점막 샘플마다 다를 수 있으며 2-3분마다 외관의 투명도를 확인해야 합니다.</li>
	<li>샘플이 투명해지면 금속 티슈 카세트 홀더에 넣은 다음 가열된 기계 내부의 액체 파라핀에 45분 동안 담급니다.</li>
	<li>파라핀을 교체하고 샘플을 가열된 기계 내부에 45분 더 둡니다.</li>
	<li>티슈 카세트 홀더를 제거하고 얼음 위에 올려 식힙니다. 냉각된 샘플 블록이 금속 홀더에서 분리되면 실온에서 추가로 냉각될 수 있습니다.</li>
	<li>블록을 RT에 저장합니다. 알림: 단면을 즉시 준비하는 것이 목적이라면 블록을 4 ° C에 배치하여 사용할 때 잘 냉각되도록 할 수 있습니다.</li>
	<li>마이크로톰을 사용하여 4μm 절편을 절단합니다.</li>
	<li>절단 된 부분을 슬라이드에 놓고 37 ° C의 오븐에서 24 시간 동안 건조시킵니다.</li>
	<li>슬라이드를 사용할 준비가 되었습니다. H&E 조직학적 염색 또는 면역-조직화학 반응 염색(항원-항체 유형)을 수행할 때까지 RT에 보관합니다.<ol><li>면역조직화학적 염색의 경우, 관심 항체(오클루딘과 같은 TJ 단백질 연구 또는 단핵구 활성화, 이동 및 분화)를 선택하고 상용 키트를 사용하여 발현(염색을 통해)을 검출합니다.</li>
		<li>마찬가지로, Alcian blue 및 주기적 acid-Schiff(PAS) 염색 키트를 사용하여 점액을 측정합니다.</li>
		<li>현미경에서 채취한 현미경 사진에서 양성 픽셀의 백분율을 계산하여 occludin과 같은 염색된 관심 TJ 단백질을 정량화합니다.</li>
		<li>이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ2 소프트웨어[Wayne Rasband, 버전 2.9.0/1.53t])를 사용하여 세포의 사진을 분석합니다.<ol><li>픽셀 분석을 수행하려면 디지털 이미지를 300픽셀/인치로 처리하고 8비트로 변환합니다. 그런 다음 Color Deconvolution 플러그인으로 바이너리 이미지를 처리하여 관심 단백질의 염색(이 경우 오클루딘의 영구적인 적색 염색)을 분석합니다.</li>
			<li>선택한 사진을 tiff로 저장하고 그래픽 편집기(예: Adobe PhotoshopCC [버전 20.0.4])로 아티팩트를 제거하기 위해 "정리" 절차를 거칩니다.</li>
			<li>그런 다음 ImageJ2의 입자 분석 응용 프로그램을 사용하여 관심 있는 모든 필드를 측정하고 데이터를 픽셀 수로 보고합니다. 참고: 각 실험은 각 반복실험에 대해 분석된 세 개의 내부 반복실험 필드를 사용하여 삼중으로 수행해야 합니다. 점액을 정량화하기 위해 픽셀을 측정하는 동일한 원리를 보라색 자홍색으로 염색된 중성 점액과 밝은 파란색으로 염색된 산성 점액을 각각 촬영한 이미지에 적용할 수 있습니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

파라핀 Embedding을 이용한 3D 장 점막 모델 구축

<ol>
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Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models.</a> Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).</li><li>Buckley, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+multiple+tight+junctional+complexes+in+human+airway+epithelial+cells.">Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells.</a> Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li></ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

여기에 제시된 기본 재구성 장 점막 모델 시스템(그림 6)은 생리학적 복잡성(섬유아세포 및 단핵구를 포함하는 ECM이 풍부한 lamina propria 지지체와 함께 Caco-2 단층을 포함하는 생리학적으로 더 관련성이 높은 3D 세포 배양)과 실험적 단순성(표준화되고 쉽게 반복 가능한 시스템을 생산하기 위해 상업용 인간 세포주를 사용)을 결합합니다.13. 따라서 이 모델 시?...

서로 다른 유형의 상피 세포를 포함하는 1 세포 두께의 내부 내막인 장 상피 장벽은 신체의 외부와 내부 환경 사이의 첫 번째 물리적 방어 장벽 또는 인터페이스를 구성합니다 1,2. 원주형 장세포는 가장 풍부한 유형의 상피세포를 구성합니다. 이들은 단단한 접합부(TJ)를 포함한 여러 장벽 구성 요소 간의 상호 작용을 통해 상피 장벽 무결성을 유지하는 역할을 하며, 장벽 강화에 중요한 역할을 합니다 1,3. TJ 구조는 조눌라 오클루덴스(zonula occludens, ZO) 및 싱귤린(cingulin)과 같은 세포내 플라크 단백질로 구성되며, 오클루딘(occludin), 클라우딘(claudin) 및 접합 접착 분자(junctional adhesion molecule, JAM)를 포함한 막관통 단백질과 협력하여 인접 세포를 단단히 연결하는 지퍼 모양의 구조를 형성합니다 3,4. 막관통 단백질은 작은 화합물의 수동 세포주위 확산을 조절하고 독성이 있는 큰 분자를 배제합니다.
잠재적으로 독성이 있는 식품 화합물 및 식품 오염 물질은 상피 투과성을 방해하고 면역 세포를 활성화하며 만성 장 조직 염증을 유발하는 염증성 사이토카인 생성을 자극합니다 5,6,7. 대조적으로, 다양한 항산화 및 항염증 파이토케미컬은 TJ 단백질 발현 및 조립 복원을 통해 염증성 사이토카인 발현을 감소시키고 장내 TJ 장벽 무결성을 향상시키는 것으로 보고되었습니다 4,6,8. 따라서 유익한 화합물과 유해 화합물 모두에 의한 상피 장벽 무결성 조절은 제약 스크리닝 및 독성 연구를 위한 장 장벽을 모방하는 것을 목표로 하는 생체 내 및 시험관 모델 모두의 사용이 증가하는 것을 보았습니다. 이는 장 질환(IBD), 괴사성 장염 및 암의 병태생리학을 이해하는 데 대한 관심이 증가함에 따라 특히 관련이 있으며, 이는 실험 모델8,9,10에서 시뮬레이션할 수 있습니다.
동물 실험에서 "3R"의 목표를 달성하기 위해 세포 기반 in vitro 모델 개발에 대한 요구가 있었습니다. 여기에는 동물 사용에 대한 대체 대안, 사용되는 동물 수의 감소, 고통을 완화하는 방법 채택의 개선이 포함됩니다 11,12,13. 더욱이, 인간과 쥐 모델(설치류가 가장 널리 사용되는 종) 사이의 근본적인 분자, 세포 및 생리학적 메커니즘은 독특하여 인간 반응의 예측 변수로서 쥐 모델의 효능에 대한 논란을 불러일으킨다12,13. in vitro 인간 세포주 모델의 수많은 장점으로는 표적 제한 실험, 직접 관찰 및 연속 분석13이 있습니다.
2차원(2D) 배양에서 단세포형 단층은 강력한 모델 역할을 했습니다. 그러나 이들은 인체 조직의 생리학적 복잡성을 정확하게 재현할 수 없다 8,13,14. 그 결과, 3D 배양 시스템은 건강한 장 조직과 병든 장 조직 모두의 생리학적 복잡성을 차세대 위험 평가 도구 상자로 요약하기 위해 지속적으로 개선되어 개발되고 있습니다13,14. 이러한 모델에는 다양한 세포주를 가진 3D Transwell 스캐폴드, 오가노이드 배양 및 세포주와 오가노이드(건강한 조직과 병든 조직 모두에서 유래)를 모두 사용하는 미세유체 장치(intestine-on-chip)가 포함됩니다8,13,14.
본 연구에서 제시된 3D "건강한 조직" 장 등가 프로토콜은 생리학적 복잡성과 실험적 단순성 사이의 균형을 맞추는 것을 기반으로 했다13. 이 모델은 3개의 세포주(면역 성분[U937 단핵구 및 L929 섬유아세포]가 있는 장세포[대장 선암종 Caco-2 계열])로 구성된 3D Transwell 스캐폴드를 대표하며, 장 상피 장벽 무결성 및 면역 반응에 대한 관심 식이 분자의 예비 스크리닝에 적용할 수 있는 표준화되고 쉽게 반복 가능한 시스템을 구성합니다. 이 프로토콜에는 고정 장 등가물을 사용하여 상피 장벽 무결성의 광현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩이 포함됩니다. 현재 접근법의 장점은 단일 실험에서 여러 매개변수에 대해 묻힌 조직의 수많은 섹션을 염색할 수 있다는 것입니다.

basic three-dimensional (3d) intestinal model system with an immune component

염증성 장 질환의 병태생리학을 연구하고, 잠재적으로 유익한 물질의 약리학적 스크리닝을 위해, 잠재적으로 유해한 식품 성분에 대한 독성 연구를 위해 생체 내 및 체외 장 모델의 사용이 증가하고 있습니다. 관련하여, 동물 모델을 대체하기 위한 세포 기반 in vitro 모델의 개발에 대한 현재 수요가 있습니다. 여기서, 세포주를 사용하는 기본적인 "건강한 조직" 3차원(3D) 장 등가 모델에 대한 프로토콜은 실험적 단순성(표준화되고 쉽게 반복할 수 있는 시스템)과 생리학적 복잡성(U937 단핵구 및 L929 섬유아세포의 지지 면역 구성 요소를 가진 Caco-2 장세포)을 모두 제공하는 두 가지 이점을 제공합니다. 이 프로토콜에는 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩도 포함되어 있어 단일 실험에서 여러 시각적 매개변수를 분석할 수 있는 이점을 제공합니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 절편은 대조군 처리에서 단단하고 규칙적인 단층을 형성하는 Caco-2 원주 세포를 보여주는 데 사용되어 실험 시스템으로서 모델의 효능을 검증합니다. 글루텐을 전염증성 식품 성분으로 사용하여 단층 두께 감소, 기저 매트릭스(H&E)로부터의 파괴 및 분리, 오클루딘 염색에서 볼 수 있듯이 밀착 접합 단백질 발현 감소(통계적으로 정량화 가능), 분화 14(CD14) 염색 클러스터 및 대식세포로의 CD11b 관련 분화에서 입증된 U937 세포 이동의 면역 활성화가 절편에서 분석된 매개변수가 포함됩니다. 장 염증을 시뮬레이션하기 위해 지질다당류를 사용하여 알 수 있듯이 측정할 수 있는 추가 매개변수는 고정 전에 배지에서 추출할 수 있는 점액 염색 증가 및 사이토카인 발현(예: 미드키네)입니다. 기본적인 3차원(3D) 장 점막 모델 및 고정 절편은 여러 시각적 정량화 가능한 매개변수를 분석할 수 있는 가능성과 함께 염증 상태 및 장벽 무결성 연구에 권장될 수 있습니다.

The intestinal epithelial barrier, a one-cell-thick internal lining containing different types of epithelial cells, constitutes the first physical defensive barrier or interface between the outside and the internal milieu of the body1,2. Columnar-type enterocytes constitute the most abundant type of epithelial cells. These are&#160;responsible for maintaining epithelial barrier integrity through interactions between several barrier components, including tight junctions (TJs), playing a significant role in barrier tightening1,3. The TJ structure consists of intracellular plaque proteins, such as zonula occludens (ZO) and cingulin, cooperating with transmembrane proteins, including occludins, claudins, and junctional adhesion molecules (JAMs) that form zipper-like structure tightly linking the neighboring cells3,4. The transmembrane proteins regulate the passive paracellular diffusion of small compounds and exclude toxic large molecules.
Potentially toxic food compounds and food contaminants stimulate inflammatory cytokine production that disrupts the epithelial permeability, activating immune cells and causing chronic intestinal tissue inflammation5,6,7. In contrast, various anti-oxidant and anti-inflammatory phytochemicals have been reported to reduce inflammatory cytokine expression and enhance intestinal TJ barrier integrity through the restoration of TJ protein expression and assembly4,6,8. Hence, the regulation of epithelial barrier integrity by both beneficial and harmful compounds has seen an increase in the use of both in vivo and in vitro models aimed at mimicking the intestinal barrier for pharmaceutical screening and toxicity studies. This is particularly relevant given the increasing interest in understanding the pathophysiology of intestinal bowel diseases (IBD), necrotizing enterocolitis, and cancer, which can be simulated in experimental models8,9,10.
There has been a demand for the development of cell-based in vitro models in order to achieve the objective of the &#8220;3Rs&#8221; in animal testing. These include replacement alternatives to the use of animals, reduction in the number of animals used, and refinement in adopting methods that alleviate distress11,12,13. Moreover, the underlying molecular, cellular, and physiological mechanisms between human and murine models (rodents being the most widely used species) are distinctive, leading to controversy regarding the efficacy of the murine models as predictors in human responses12,13. Numerous advantages of in vitro human cell-line models include target-restricted experimentation, direct observation, and continuous analysis13.
Single-cell-type monolayers in two-dimensional (2D) cultures have served as powerful models. However, these cannot precisely reproduce the physiological complexity of human tissues8,13,14. As a result, 3D&#160;culture systems are being developed with ever-increasing improvements to recapitulate the physiological complexity of both healthy and diseased intestinal tissues as next-generation risk assessment toolboxes13,14. These models include 3D Transwell scaffolds with diverse cell lines, organoid cultures, and microfluidic devices (intestine-on-chip) using both cell lines and organoids (derived from both healthy and diseased tissues)8,13,14.&#160;
The 3D &#8220;healthy tissue&#8221; intestinal equivalent protocol presented in the present study was based on striking a balance between physiological complexity and experimental simplicity13. The model is representative of a 3D Transwell scaffold, comprised of three cell lines (enterocytes [the gold-standard colon adenocarcinoma Caco-2 line] with a supporting immune component [U937 monocytes and L929 fibroblasts]), constituting a standardized and easily repeatable system applicable for the preliminary screening of dietary molecules of interest on intestinal epithelial barrier integrity and immune response. The protocol includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of epithelial barrier integrity using fixed intestinal equivalents. The advantage of the present approach is that numerous sections of the embedded tissues can be made to stain for multiple parameters from a single experiment.

저자 스포트라이트: 3D 인간 세포주 모델을 사용하여 화합물이 장 조직에 미치는 영향 조사 

면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템

The scope of the work is to use these in vitro three-dimensional human cell line models to investigate the fact of beneficial as well as helpful compounds on intestinal tissue. The models can be used to further research understanding and also as a basic drug model. Using the plant-derived compounds, spermidine and eugenol, both separately and together in supplement form, we measure beneficial increases in autophagy and decreases in inflammation using these models.Then we will also able to show the potentially harmful effect of gluten extracted from certain wheat varieties on intestinal tissues. We are currently using economically priced, standardized, and easily repeatable in vitro system that better reflect the physiology of the human intestine as an alternative to animal models. Since we also use commercial human cell line rather than plant-derived cells, the responses from the study are more applicable to the general population.The protocol is based entirely on the use of different lines. These renders the model most standardized and reproducible. Furthermore, the simultaneous cultivation of different cell lines, enterocytes, fibroblasts, and immune system cells, allows for cellular responses that are closer to what happens in the patient.

첫 번째 중요한 측면은 실험 목적으로 기본 3D 장 등가 점막의 수용 가능성을 결정하는 것입니다. 이것은 조직학 및 조직 병리학 실험실에서 가장 널리 사용되는 염색, 즉 hematoxylin (핵 물질을 짙은 파란색-보라색으로 염색) 및 eosin (분홍색의 다양한 음영으로 세포질 물질을 염색)으로 수행됩니다. H&E 염색은 먼저 처리되지 않은 대조군에서 수행되며, 실험적 처리와 동일한 조건 및 시간 프레임에서 ...

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여기서는 기본 3차원(3D) 장 세포주 모델 시스템과 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩 프로토콜을 구성하는 방법을 설명합니다. 선택한 단백질의 염색을 통해 단일 실험에서 여러 시각적 파라미터를 분석하여 전임상 약물 스크리닝 연구에 사용할 수 있습니다.

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...

이 연구의 범위는 이러한 체외 3차원 인간 세포주 모델을 사용하여 장 조직에 유익하고 유용한 화합물의 사실을 조사하는 것입니다. 이 모델은 추가 연구, 이해 및 기본 약물 모델로 사용할 수 있습니다. 식물 유래 화합물인 스퍼미딘과 유제놀을 보충제 형태로 단독으로 또는 함께 사용하여 이러한 모델을 사용하여 자가포식의 유익한 증가와 염증 감소를 측정합니다.그런 다음 특정 밀 품종에서 추출한 글루텐이 장 조직에 미치는 잠재적으로 해로운 영향도 보여줄 수 있습니다. 우리는 현재 동물 모델의 대안으로 인간 장의 생리학을 더 잘 반영하는 경제적으로 가격이 책정되고 표준화되고 쉽게 반복할 수 있는 체외 시스템을 사용하고 있습니다. 우리는 또한 식물 유래 세포가 아닌 상업용 인간 세포주를 사용하기 때문에 연구의 반응은 일반 인구 집단에 더 적합합니다.프로토콜은 전적으로 다른 라인의 사용을 기반으로 합니다. 이를 통해 모델을 가장 표준화되고 재현 가능하게 렌더링할 수 있습니다. 또한 서로 다른 세포주, 장세포, 섬유아세포 및 면역계 세포를 동시에 배양하여 환자에게 일어나는 것과 더 가까운 세포 반응을 가능하게 합니다.

basic-three-dimensional-3d-intestinal-model-system-with-an-immune

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

715 조회수.  Alma Mater Studiorum-University of Bologna. 이 연구의 범위는 이러한 체외 3차원 인간 세포주 모델을 사용하여 장 조직에 유익하고 유용한 화합물의 사실을 조사하는 것입니다. 이 모델은 추가 연구, 이해 및 기본 약물 모델로 사용할 수 있습니다. 식물 유래 화합물인 스퍼미딘과 유제놀을 보충제 형태로 단독으로 또는 함께 사용하여 이러한 모델을 사용하여 자가포식의 유익한 증가와 염증 감소를 측정합니다.그?...

비디오: 저자 스포트라이트: 3D 인간 세포주 모델을 사용하여 화합물이 장 조직에 미치는 영향 조사 

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

연구

생물학

Preparation of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Microscopic Evaluation of Fixed Intestinal Equivalents

To begin, select a 24-well plate containing inserts with 0.4 micron filters. Using a pipette, add 500 microliters of HBSS below and above the filter inserts. Then close the multi-well plate and place it in an incubator for two hours.After incubation, carefully aspirate the HBSS from the plate. Prepare a cell-free collagen solution in a sterile 50 milliliter tube in DMEM on ice. Add 250 microliters of collagen above the membrane filter and place the lid on the plate.Allow the solution to polymerize at room temperature. Next, remove the L-929 fibroblast cell culture from the incubator. Add two milliliters of a pre-warmed trypsin EDTA solution to the flask and place it in an incubator for three to five minutes.Transfer the cell suspension to a sterile 15 milliliter tube and centrifuge at 645 G for five minutes. Using a vacuum pump, aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM. Add 20 microliters of cell suspension into a tube containing 20 microliters of Trypan Blue solution.And use a cell counting chamber to evaluate the cell density. Next, remove the U-937 monocyte cell culture from the incubator. Centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of RPMI.After ensuring cells are homogeneously suspended, count them using a cell counting chamber. Next, prepare cell suspensions containing 50, 000 L-929 and 15, 000 U-937 cells respectively in 50 microliters of DMEM. Add each 50 microliter cell suspension to 450 microliters of collagen and mix thoroughly.Overlay the pre-coded cell-free lamina propria with 500 microliters of the collagen cell solution. Close the plate and place it in an incubator for two hours to allow the solution to set. Next, remove the Caco-2 cell culture from the incubator.Using a vacuum pump, aspirate the medium and rinse the cells with 10 milliliters of PBS. Add five milliliters of PBS trypsin EDTA solution and place it in an incubator for five to eight minutes. Then centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM.After counting, prepare a cell suspension containing 150, 000 Caco-2 cells in 50 microliters of DMEM. Place the plate in a laminar flow hood for 10 minutes before transferring it to the incubator. After 30 minutes, add 500 microliters of the DMEM above the reconstructed model and 500 microliters below the filter and return the plate to the incubator.The next day, carefully replace the medium with 500 microliters of fresh DMEM above and below the filter respectively.

고정 장 등가물의 현미경 평가를 위한 기본 3D 재구성 장 점막 모델 준비

Paraffin Embedding of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Immune-Histochemical Staining

For paraffin embedding of cells, set the paraffin machine to 58 degrees Celsius. Using pliers, transfer the membrane inserts to clean wells of a sterile 24-well plate. Add 500 microliters of 37%buffered formalin and PBS above the filter, and one milliliter below the filter.Close the lid and leave the plate in a fume hood for two hours. Once the lamina propria is detached from the membrane insert, transfer the intestinal mucosa into a beaker containing 25 milliliters of 35%ethanol, and incubate for 10 minutes. After dehydration in increasing ethanol concentrations, place the samples in 50 milliliters of xylene or a histological clearing agent for 10 to 20 minutes.Once the samples are transparent, place them in a metal tissue cassette holder and submerge them in liquid paraffin inside a heated machine. After 45 minutes, use a microtome to cut four micron sections. Place the cut section on the slides and dry them in an oven at 37 degrees Celsius for 24 hours.An acceptable 3-D intestinal equivalent mucosa model consists of Caco-2 cells formed in a tight and regular monolayer above the extracellular-matrix-rich lamina propria. Unacceptable models include those showing excessive growth, disorganized epithelial layers, malformation or lack of epithelial layer formation. The proinflammatory effect of wheat protein with a high gluten content disrupted the cellular monolayer and reduced the thickness of the epithelial layer compared to the control group.The occludin protein content was significantly higher in the control group than in the group exposed to gluten protein. CD14 and CD11b staining of U937 monocytes showed that wheat protein with a high gluten content activated the monocytes, and induced their migration and differentiation into macrophages. Under the lipopolysaccharide challenge, Caco-2 cells increased mucus production and the release of the inflammatory marker midkine.