이 연구는 중국 국립자연과학재단(82130012 및 81830010)과 상하이 흉부 병원의 기초 연구를 위한 육성 프로젝트(보조금 번호: 2022YNJCQ03)의 지원을 받았습니다.

동물 프로토콜은 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 부속 상하이 흉부 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호: KS23010)의 승인을 받았으며 관련 윤리 규정을 준수했습니다. 이 실험에는 4-8주 된 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스가 선호된다.
1. 수술 도구, 완충액 및 배양 배지의 준비
<ol><li>수술 도구(예: 수술용 가위 및 표준 집게)를 121°C에서 30분 동안 오토클레이브합니다. 미세 수술 기구를 75% 알코올로 소독합니다.</li>
	<li>1% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)와 10% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 또 다른 10mL의 PBS를 준비합니다. 알림: 다음 섹션에서 구체적으로 언급되지 않은 경우 PBS는 일반 멸균 PBS를 나타냅니다.</li>
	<li>Krebs Ringer HEPES BSA 완충액 준비: 1% 소 혈청 알부민(BSA), Krebs Ringer 용액에 용해된 20mM HEPES.</li>
	<li>신선한 분해 용액 준비: Krebs Ringer HEPES BSA 완충액에 용해된 유형 1 콜라겐분해효소(1mg/mL) 및 dispase II(4mg/mL). 0.2μm 필터를 사용하여 용액을 멸균합니다.</li>
	<li>콜라겐 코팅된 12웰 플레이트를 준비합니다.<ol><li>콜라겐 용액(1mg/mL)을 멸균 탈이온수로 40μg/mL 농도로 희석합니다. 각 웰의 표면에 희석된 콜라겐 용액 1mL를 첨가하여 6-10μg/cm2의 농도를 얻습니다. 실온에서 1시간 동안 코팅을 배양합니다.</li>
		<li>남은 용액을 제거하고 PBS 1mL로 각 웰을 2번 헹굽니다. 플레이트를 즉시 사용하거나 클래스 II 층류 후드에서 플레이트를 자연 건조하고 코팅된 플레이트를 2-8°C에서 보관하십시오. 보관할 때는 코팅된 플레이트를 파라필름으로 밀봉하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>배양 배지 준비: 고포도당 Dulbecco's-Modified Eagles 배지(DMEM), 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신. 최대 2주 동안 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>고포도당 DMEM, 10% FBS, 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신, 1nM 트리요오드티로닌, 1μM 로시글리타존, 1μM 인슐린, 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX) 및 1μM 덱사메타손. 최대 2주 동안 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>유지 배지 준비: 고포도당 DMEM, 10% FBS, 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신, 1nM 트리요오드티로닌, 1μM 로시글리타존 및 1μM 인슐린. 최대 2주 동안 4 °C에서 보관하십시오.</li>
</ol>2. 혈관 주위 지방 조직(PVAT)의 해부 및 분리
<ol><li>2% 이소플루란 마취 또는 이산화탄소 과다 투여로 자궁경부 탈구로 쥐를 안락사시킵니다. 피부 소독을 위해 75% 알코올을 뿌립니다.</li>
	<li>마우스를 누운 자세(위쪽을 향함)에 놓습니다.</li>
	<li>피부를 들어 올려 작은 절개를 하고 골반에서 목까지 복부 정중선을 따라 수술용 가위로 피부와 복부 근육을 뭉툭하게 분리합니다. 정중선의 양쪽을 따라 횡격막과 갈비뼈를 절단하여 심장과 폐를 노출시킵니다.</li>
	<li>간, 비장, 장 및 신장을 조심스럽게 제거합니다. 장 벽을 자르지 마십시오.</li>
	<li>폐와 식도를 제거하십시오.</li>
	<li>한 손에는 집게로 심장을 부드럽게 들어 올리고 다른 한 손에는 수술용 가위로 대동맥과 척추를 분리합니다. 그런 다음 심장과 대동맥을 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 PBS가 있는 60mm 페트리 접시에 담습니다.</li>
	<li>알코올에서 미세 수술 겸자와 미세 수술 가위를 제거하고 PBS 25mL로 헹구어 여분의 알코올을 제거합니다. 실체 현미경으로 심장과 대동맥에서 흉선과 기타 조직을 제거한 다음 심장을 제거하고 대동맥에 PVAT를 남깁니다.</li>
	<li>PVAT가 있는 대동맥을 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 PBS가 있는 깨끗한 60mm 페트리 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>미세수술용 겸자를 사용하여 PVAT를 제거하고, 한 쌍의 겸자는 대동맥을 고정하고 다른 한 쌍은 지방 조직을 잡아당깁니다. 혈관 주위 지방 조직의 손상을 최소화하면서 혈관 조직을 최대한 제거합니다.</li>
	<li>흉부 대동맥을 둘러싼 PVAT를 얼음 위에 놓인 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 고포도당 DMEM이 포함된 2mL 미세 원심분리 튜브에 수집합니다.</li>
</ol>3. 기질 혈관 분획 (SVF)의 분리
<ol><li>수집된 조직을 10% v/v 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 PBS와 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 PBS로 순차적으로 헹굽니다. 참고: 이 단계부터 모든 실험은 클래스 II 층류 후드의 멸균 조건에서 수행해야 합니다.</li>
	<li>조직을 멸균 된 60mm 페트리 접시에 옮기고 200 μL의 분해액을 첨가 한 다음 멸균 가위를 사용하여 1mm3 조각으로 다집니다.</li>
	<li>플라스틱 피펫 팁을 사용하여 혼합물을 15mL 원심분리 튜브로 옮기고, 멸균 가위로 절단하여 끝을 넓히고, 6mL의 분해 용액을 추가하여 분해 반응을 시작합니다. 참고: 1회의 분해 반응(3mL의 분해 용액)은 6마리의 마우스에서 추출한 PVAT 저장소에 충분합니다.</li>
	<li>37°C에서 궤도 셰이커(효과적인 혼합을 위한 150rpm 주파수)가 있는 인큐베이터에서 30-45분 동안 조직을 배양합니다. 튜브를 랙에 평평하게 묶어 튜브가 수평으로 흔들리도록 합니다. 10-5분마다 10초 동안 손으로 위아래로 세게 흔듭니다. 알림: 조직 조각이 남지 않은 상태에서 균질하고 황색을 띤 소화액이 보이면 소화를 중단할 수 있습니다.</li>
	<li>70μm 세포 스트레이너를 통해 50mL 원심분리 튜브에 분해된 조직을 걸러냅니다. 세포 스트레이너를 동일한 양의 배양 배지로 헹구어 세포 수율을 최대화하고 소화를 중지합니다.</li>
	<li>여과액을 새 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 1,800× g 의 속도로 10분 동안 원심분리합니다. 튜브를 뒤집어 상층액을 버리고 펠릿을 5mL의 PBS에 재현탁시킵니다. 1,800 × g 에서 5분 동안 원심분리기</li>
	<li>튜브를 뒤집어 상층액을 버리고 적절한 양의 배양 배지에 펠릿을 재현탁시킵니다. 참고: 6마리의 마우스마다 수집된 세포 펠릿을 1mL의 배양 배지에 재현탁시키고 12웰 플레이트의 웰 1개에 파종합니다.</li>
	<li>세포를 콜라겐으로 코팅된 12웰 플레이트에 파종하고 37°C에서 5%CO2 가 함유된 습한 환경에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>다음날 배양 배지를 흡인하고 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 예열된(37°C) PBS로 세포를 세척하여 세포 파편과 적혈구를 제거하고 신선한 배양 배지 1mL를 각각 웰에 다시 추가합니다.</li>
</ol>4. 대동맥 주위 지방 조직에서 SVF 유래 지방세포의 지방형성 유도
<ol><li>세포가 ~60-70% 합류할 때까지 이틀에 한 번씩 배양 배지를 교체합니다. 참고 : 세포가 3-4 % 합류에 도달하는 데 일반적으로 60-70 일이 걸립니다.</li>
	<li>세포가 60-70% 합류에 도달하면 배양 배지를 흡인하고 갈색 지방 유도 배지로 교체합니다. 지방 분화가 유도되는 날을 분화의 0 일로 생각하십시오.</li>
	<li>72시간(분화 3일차) 후 유지 배지로 배지를 새로 고칩니다. 세포가 실험에 사용될 때까지 2일마다 유지 배지를 교체합니다.</li>
	<li>지방 세포를 Oil Red O 염색(14 ) 및 웨스턴 블로팅(western blotting)(15)과 같은 적절한 방법으로 분석한다.</li>
</ol>

Murine Perivascular Adipose Tissue에서 분리된 지방세포(preadipocytes) 배양

<ol>
	<li>Akoumianakis, I., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+between+adipose+tissue+and+the+cardiovascular+system:+is+fat+always+bad.">The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad.</a> Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).</li><li>Huang, C. 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저자는 재정적 또는 기타 이해 상충을 선언하지 않습니다.

우리는 마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 SVF 유래 지방세포의 분리 및 지방 유도를 위한 실용적이고 실현 가능한 접근 방식을 제안합니다. 이 프로토콜의 장점은 간단하고 경제적이라는 것입니다. 조직이 부족하면 SVF 밀도가 낮아지고 성장 상태가 좋지 않아 궁극적으로 지방 생성 효율에 영향을 미칠 수 있으므로 적절한 수의 마우스가 성공적인 분리에 매우 중요합니다. 또한 마우스 나이는 SVF?...

성숙한 지방세포와 기질혈관분획(SVF)의 혼합물로 구성된 혈관주위 구조인 혈관주위 지방조직(PVAT)은 분비체를 통해 인접한 혈관벽과 상호작용하는 것으로 여겨진다1. 혈관 항상성의 중요한 조절자인 PVAT 기능 장애는 심혈관 질환의 발병기전과 관련이 있습니다 2,3,4. 지방 세포 조직의 SVF는 내피 세포, 면역 세포, 중피 세포, 신경 세포, 지방 줄기 및 전구 세포(ASPC)를 포함한 여러 예상 세포 집단으로 구성됩니다5,6. 지방 조직의 SVF에 존재하는 ASPC가 성숙한 지방 세포를 발생시킬 수 있다는 것은 잘 알려져 있다5. SVF는 PVAT에서 성숙한 지방 세포의 중요한 공급원으로 추론됩니다. 여러 연구에 따르면 PVAT-SVF는 특정 유도 조건 6,7,8에서 성숙한 지방 세포로 분화할 수 있습니다.
현재 지방 조직에서 SVF를 분리하기 위한 두 가지 분리 시스템이 있는데, 하나는 효소 소화이고 다른 하나는 비효소분해입니다 9. 효소적 방법은 전형적으로 핵이 형성된 전구세포(nucleated progenitor cell)의 수율을 높인다(10). 현재까지 상처 치유, 비뇨생식기 및 심혈관 질환에서 혈관 재생 및 신생혈관 형성을 촉진하는 SVF의 이점은 특히 피부과 및 성형 외과에서 널리 입증되었습니다11 12,13. 그러나 PVAT 유래 SVF의 임상 적용 전망은 잘 탐구되지 않았으며, 이는 PVAT에서 SVF를 분리하기 위한 표준화된 방법이 없기 때문일 수 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 흉부 대동맥을 둘러싼 마우스 PVAT에서 SVF 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방생성 유도를 위한 표준화된 접근 방식을 확립하여 PVAT 기능에 대한 추가 조사를 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 어린 마우스에서 얻은 대동맥 주위 지방 세포를 배양하기 위한 조직 처리 및 세포 분화 기술을 최적화합니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filters</td>
			<td>PALL</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate&#160;</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>11210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>310109003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-L-thyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-2877</td>
			<td>1 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>CT-002-50A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-adiponectin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22554</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-COX IV</td>
			<td>CST</td>
			<td>4850</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FABP4</td>
			<td>CST</td>
			<td>2120</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PGC1&#945;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab191838</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PPAR&#947;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-14889</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-UCP1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10983</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Actinin</td>
			<td>CST</td>
			<td>6487</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes</td>
			<td>Shanghai Model Organisms Center, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m, nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-25G</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with orbital shaker</td>
			<td>Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.</td>
			<td>LYZ-103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (cattle)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11070-73-8</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Ringer&#39;s Solution</td>
			<td>Pricella&#160;</td>
			<td>PB180347</td>
			<td>protect from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O&#160;</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>A600395-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>B548117-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:5,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td>1:5,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue

혈관 주위 지방 조직(PVAT)은 혈관을 둘러싸고 흰색, 베이지색 및 갈색 지방 세포의 표현형을 나타내는 지방 조직 저장소입니다. 최근의 발견은 혈관 항상성을 조절하고 심혈관 질환의 발병에 참여하는 PVAT의 중심적인 역할을 조명했습니다. PVAT 특성 및 규제에 대한 포괄적인 이해는 미래 치료법 개발에 매우 중요합니다. 대동맥 주위 지방세포의 1차 배양은 PVAT 기능과 대동맥 주위 지방세포와 혈관 세포 간의 누화를 연구하는 데 유용합니다. 이 논문은 생쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방생성 유도를 위한 경제적이고 실현 가능한 프로토콜을 제시하며, 이는 시험관 내 지방 형성 또는 지방 형성 모델링에 유용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 어린 마우스에서 대동맥 주위 지방 세포를 배양하기 위한 조직 처리 및 세포 분화를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 PVAT 기능 조사를 위한 벤치 측의 기술적 초석을 제공할 것입니다.

Perivascular adipose tissue (PVAT), a perivascular structure composed of a mixture of mature adipocytes and a stromal vascular fraction (SVF), is believed to interact with the adjacent vessel wall via its secretome paracrineally1. As a critical regulator of vascular homeostasis, PVAT dysfunction is implicated in the pathogenesis of cardiovascular diseases2,3,4. The SVF of adipocyte tissue consists of several expected cell populations, including endothelial cells, immune cells, mesothelium cells, neuronal cells, and adipose stem and progenitor cells (ASPCs)5,6. It is well known that ASPCs residing in the SVF of adipose tissue can give rise to mature adipocytes5. SVF is inferred to be a critical source of mature adipocytes in PVAT. Several studies have shown that PVAT-SVF can differentiate into mature adipocytes under specific induction conditions6,7,8.
Currently, there are two isolation systems for isolating SVF from adipose tissue, one is enzymatic digestion and the other is non-enzymatic9. Enzymatic methods typically result in a higher yield of nucleated progenitor cells10. To date, the benefits of SVF in promoting vascular regeneration and neovascularization in wound healing, urogenital, and cardiovascular diseases have been widely demonstrated11, especially in dermatology and plastic surgery12,13. However, the clinical application prospects of PVAT-derived SVF have not been well explored, which may be attributed to the lack of a standardized method for the isolation of SVF from PVAT. The objective of this protocol is to establish a standardized approach for the isolation, culture, and adipogenic induction of SVF-derived preadipocytes from mouse PVAT surrounding the thoracic aorta, enabling further investigation of PVAT function. This protocol optimizes tissue processing and cell differentiation techniques for culturing periaortic adipocytes obtained from young mice.

저자 스포트라이트: 마우스 혈관 주위 지방 조직에서 SVF 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방형성 유도의 중요성 

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue(마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도)

We aim to establish a standardized approach for the isolation culture and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mass PVAT. This protocol enables us to conduct further investigations into PVAT function and into the communication between periaortic adipocytes and vascular cells in vitro. The main challenges we currently face in our experiments include the restricted of availability of PVAT and the requirements for additional human and the material resources when compared to using immortalized preadipocytes.Our protocol allows for the study of perivascular adipose tissue function and it's relationship with vascular cells. We also offers a basis for studying PVAT ring and genes, and heterogeneity, and provides a platform for exploring the important regulator of PVAT differentiation and the adipogenesis in vitro.

위에서 설명한 이 프로토콜을 사용하여 쥐 흉부 대동맥을 둘러싼 PVAT를 조심스럽게 분리했습니다(그림 1A-D). 멸균 가위(그림 1E,F)를 사용하여 PVAT를 세척하고 작은 조각으로 다진 후(그림 1E,F), 조직 단편을 제1형 콜라겐분해효소(1mg/mL) 및 디스파제 II(4mg/mL)를 함유한 소화액에서 분해하고 셰이커에서 37°C에서 30-45분 동안 배양했습니다(<str...

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여기서는 생쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도를 설명하여 혈관 주위 지방 조직 기능 및 혈관 세포와의 관계를 연구할 수 있습니다.

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown ...

우리는 대량 PVAT에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리 배양 및 지방 유도를 위한 표준화된 접근 방식을 확립하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜을 통해 PVAT 기능과 체외에서 대동맥 주위 지방 세포와 혈관 세포 간의 통신에 대한 추가 조사를 수행할 수 있습니다. 현재 실험에서 직면하고 있는 주요 과제는 PVAT의 가용성이 제한되어 있다는 점과 불멸화된 지방세포를 사용하는 것과 비교할 때 추가적인 인적 및 물적 자원에 대한 요구 사항입니다.우리의 프로토콜은 혈관 주위 지방 조직 기능과 혈관 세포와의 관계에 대한 연구를 허용합니다. 또한 PVAT 고리 및 유전자, 이질성을 연구하기 위한 기초를 제공하고 PVAT 분화 및 체외 지방 형성의 중요한 조절자를 탐구하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

isolation-culture-adipogenic-induction-stromal-vascular-fraction

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

1.2K 조회수.  Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. 우리는 대량 PVAT에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리 배양 및 지방 유도를 위한 표준화된 접근 방식을 확립하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜을 통해 PVAT 기능과 체외에서 대동맥 주위 지방 세포와 혈관 세포 간의 통신에 대한 추가 조사를 수행할 수 있습니다. 현재 실험에서 직면하고 있는 주요 과제는 PVAT의 가용성이 제한되어 있다는 점과 불멸화된 지방세포를 사...

비디오: 저자 스포트라이트: 마우스 혈관 주위 지방 조직에서 SVF 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방형성 유도의 중요성 

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown adipocytes. Recent discoveries have shed light on the central role of PVAT in regulating vascular homeostasis and participating in the pathogenesis of cardiovascular diseases. A comprehensive understanding of PVAT properties and regulation is of great importance for the development of future therapies. Primary cultures of periaortic adipocytes are valuable for studying PVAT function and the crosstalk between periaortic adipocytes and vascular cells. This paper presents an economical and feasible protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, which can be useful for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro. The protocol outlines tissue processing and cell differentiation for culturing periaortic adipocytes from young mice. This protocol will provide the technological cornerstone at the bench side for the investigation of PVAT function.

Here, we describe the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, allowing for the study of perivascular adipose tissue function and its relationship with vascular cells.

연구

생물학

Dissection and Isolation of Murine Perivascular Adipose Tissue (PVAT)

Begin by spraying the properly euthanized mouse with 75%alcohol to disinfect the skin. Then place the mouse in a supine position. Lift the skin of the animal's abdominal region, and using surgical scissors, make a small incision in it.Then using the scissors, bluntly separate the skin and abdominal muscles from the pelvis to the neck, along the ventral midline. Expose the heart and lungs by cutting the diaphragm and ribs along both sides of the midline. Next, carefully remove the liver, spleen, bowels, and kidney, avoiding damage to the intestinal wall.Following that, remove the lungs and esophagus. Now gently lift the heart using forceps held in one hand and separate the aorta from the spine with surgical scissors held in the other hand. Then place the heart and aorta in a 60 millimeter petri dish, containing antibiotic supplemented PBS.Retrieve the microsurgical forceps and microsurgical scissors from the alcohol, and rinse them in 25 milliliters of PBS to remove excess alcohol. Working under a stereo microscope, remove the thymus and other tissues from the heart and aorta. Then remove the heart, leaving the aorta with the perivascular adipose tissues or PVATs.Transfer the aorta along with the PVATs to a clean 60 millimeter petri dish containing antibiotic supplemented PBS. Using one pair of microsurgical forceps, hold the aorta, and using another pair, pull off the attached adipose tissues to separate the PVATs from the aorta. Remove as much vascular tissue as possible while causing minimal harm to the PVATs.Finally, transfer the collected PVATs into a two milliliter microcentrifuge tube, containing antibiotic supplemented, high glucose, DMEM, placed on ice.

쥐 혈관 주위 지방 조직(PVAT)의 해부 및 격리

Isolation of Stromal Vascular Fraction (SVF) from Perivascular Adipose Tissue (PVAT)

While working under a class two laminar flow hood, begin by sequentially washing the perivascular adipose tissues or PVATs collected from mice two times. First, using PBS containing 10%penicillin-streptomycin, and, next, using PBS supplemented with 1%penicillin-streptomycin. Transfer the rinsed tissues into a sterile 60-millimeter Petri dish and add 200 microliters of digestion solution to it.Using sterile scissors, mince the tissues into pieces having a dimension of one cubic millimeter. With the help of sterile scissors, cut a plastic pipette tip to broaden its end. Then transfer the minced tissue mix to a 15-milliliter centrifuge tube using the broad-ended pipette tip.Add six milliliters of the digestion solution to the tissues to initiate digestion. After tying the tube horizontally on a rack, incubate it at 37 degrees Celsius in an orbital shaker for 30 to 45 minutes. Every 5 to 10 minutes, remove the tube from the shaker in the incubator and manually shake it up and down vigorously.Pass the digested tissue mix through a 70-micron cell strainer into a 50-milliliter centrifuge tube. Rinse the strainer with an equal volume of culture medium to maximize cell yield and quench digestion. Transfer the filtrate to a new 15-milliliter centrifuge tube.Centrifuge the tube to isolate the stromal vascular fraction or SVF. Invert the tube to discard the supernatant and re-suspend the pellet in five milliliters of PBS. Centrifuge the tube again at 1, 800 G for five minutes before discarding the supernatant.Re-suspend the pellet in an appropriate volume of culture medium. Seed the cells into a collagen-coated 12-well plate and incubate overnight at 37 degrees Celsius in a humid atmosphere with 5%carbon dioxide. On the next day, remove cell debris and red blood cells by aspirating the culture medium and washing the cells with antibiotic-supplemented PBS pre-warmed to 37 degrees Celsius.Finally, add one milliliter of fresh culture medium to each well, and continue culturing the cells until they reach the desired stage of confluency.