우리의 간단하고 실용적인 방법론은 체외에서 PVAT 분리 발생을 연구하고 비만 및 관련 심혈관 질환에 대한 정상적인 약물을 테스트하기 위해 풍부한 ADSCS를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 FACS, 또는 자기 활성화 세포 분류에 대한 플루 크롬 공주 항체로 세포를 라벨링할 필요가 있는 비오틴의 NCADS의 내재된 형광이다. 이 방법은 ECtoderm에서 신경 문장 세포로부터 유래된 풍부한 ADSC를 획득하여 PVAT 증분 발생, 또는 시험관내 리포발생을 연구하는 데 사용될 수 있다.
젊은 마우스를 사용하고 소작과 유도 된 송포 발생을 경험하는 것은 3T3 세포가이 프로토콜의 성공에 중요하다는 것을 의미합니다. 절차를 시연하는 것은 대학원 생인 이딩 치(Yiding Qi)와 제 실험실의 기술자인 Lian Xu가 될 것입니다. PAAT 해부의 경우 마우스 시체를 75%에탄올로 5분간 살균한 후 가위를 사용하여 복부에 피부를 잘라내고 분리합니다.
복부 중간선을 골반에서 목으로 자르고 복부를 엽니다. 간을 움직이면 다이어프램을 노출시키고, 중간선 양쪽의 다이어프램과 갈비뼈를 잘라냅니다. 갈비뼈를 벗겨서 심장과 폐를 노출시합니다.
그리고 폐와 흉구를 제거합니다. 대자와 하트와 함께 PAAT를 페트리 접시에 넣습니다. 그리고 대동맥 뿌리에서 대동맥을 잘라 심장을 제거합니다.
그런 다음 대동맥 아치와 내림차순 대동맥 사이에 잘라냅니다. 두 구조를 둘러싼 지방 조직과 왼쪽과 오른쪽 공통 경동맥을 후방 가슴 벽에서 조심스럽게 분리합니다. PAAT를 뿌리에서 분리하고 더 큰 혈관 혈관으로서 신중하게 분리하는 것이 중요하며, 혈관 벽 세포의 존재는 FACS 효율성에 영향을 미칠 수 있다.
얼음 차가운 HBSS 버퍼를 포함하는 페트리 접시에 조직을 놓습니다. 그리고 멸균 집게를 사용하여 가능한 한 많은 혈관과 근막을 제거하십시오. 그런 다음, 얼음에 얼음 차가운 HBSS 버퍼의 포인트 5 밀리리터를 포함하는 2 밀리리터 Eppendorf 튜브로 지방 조직을 전송합니다.
PAAT가 모두 수집되면 수확한 지방 조직을 새로 준비된 소화 매체 1밀리리터를 포함하는 새로운 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 이송합니다. 그리고 조직을 다진 외과 가위를 사용합니다. 조직 슬러리를 신선한 소화 배지9밀리리터를 포함하는 50mm 튜브로 옮기.
그리고 조직을 10 번 세트리술하기 위해 1 밀리리터 파이펫을 사용합니다. 균질한 용액을 얻었을 때, 튜브를 섭씨 37도에서 30~45분, 분당 100회 회전으로 배양하여 5~10분간격으로 과다소화를 방지합니다. 가벼운 노란색 균질 성 지방 조직 용액이 튜브의 부드러운 소용돌이시 관찰 할 수 있을 때, 10 %의 태아 소 혈청으로 보충 된 HDMEM의 5 밀리리터로 소화를 중지합니다.
철저한 혼합 후, 원심분리기는 지방 조직 샘플을 원심분리합니다. 기질 혈관 세포 분수는 갈색 펠릿으로 볼 수 있습니다. 배양 배지의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 필터링한다.
다른 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 그리고 적혈구 용해 버퍼의 5 밀리리터에서 펠릿을 부드럽게 다시 중단합니다. 서스펜션을 15 밀리리터 튜브로 옮기십시오.
10 분 후, PBS의 10 밀리리터에서 두 개의 원심 분리로 반응을 중지, 1 %의 태아 소 혈청으로 보충. 두 번째 원심 분리 후, 얼음에 문화 배지의 다섯 밀리리터에 펠릿을 다시 중단. 그리고 최종 원심분리로 세포를 수집한다.
그런 다음, 계산을 위해 FACS 버퍼의 5밀리리터에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 표준 프로토콜에 따라 FACS에 의해 격리된 후, NCADSC 배양을 설정하려면 세포를 각 우물에서 3센티미터 제곱농도로 5배 10에 배치하여 12개의 잘 배양플레이트를 배치한다. 불완전한 배양 배지는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 20~24시간 동안 가능합니다.
다음 날, 37섭씨 PBS로 세포를 씻고, 신선한 배양 배지로 배양에 먹이를 주세요. 배양이 80~90%에 도달하면 섭씨 37도에서 3~5분 동안 잘 하면 0.25%의 트립신 EDTA2밀리리터로 세포를 치료한다. 세포가 플레이트의 바닥에서 분리되었을 때, 배양 된 배지의 2 밀리리터로 효소를 중화시키고 원심 분리에 의해 수확 된 세포를 수집합니다.
계산을 위한 신선한 배양 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 그리고 새로운 12 개의 잘 배양 플레이트에서 세포를 5 회 10 내지 제3 세포에 제곱 농도로 시드한다. 이어서, 액체 질소의 냉동 저장을 위해 10%디메틸 설옥산화물으로 보충된 배양 배지에서 남은 세포를 다시 중단한다.
세포가 80~ 90%의 합류에 도달하면, 세포가 80~90%의 합류에 도달하면, 적절한 2일 동안 갈색 또는 백색 증식 유도 배지로 세포를 치료한다. 인큐베이션이 끝나면, PBS로 세포를 두 번 부드럽게 세척한 후 적절한 신선한 흡착 유도 배지를 각 우물에 추가하고, 세포를 추가로 3~5일 동안 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보냅니다. 배양 된 NCADS는 문화의 7 ~ 8 일 후 80 ~ 90 %의 합류에 도달합니다.
그리고 형태와 같은 확장 된 유리 섬유를 시연합니다. 그들의 비대화 잠재력을 더욱 확인하기 위해, 차별화된 NCADS의 오일 레드 스테인링은 성숙한 지방세포들을 검출하기 위해 수행될 수 있다. 전형적으로, 성숙한 지방세포는 NCADSC의 60% 이상이 선화분화를 나타내는 백색 또는 갈색 유도8일 후에 관찰된다.
NCADS는 합격 후 크게 감소 된 성포성 잠재력을 보여줍니다. 면역 블로팅 및 정량적 실시간 PCR은 백색 아디포겐성 유도8일 후에 인디포겐화 특이적 인 NCADSCs에서 지방분화 특이적 상대 단백질 및 유전자의 발현이 현저하게 증가한다는 것을 밝힙습니다. 유사하게, 지방세포 특이적 유전자의 발현, 및 갈색 지방세포 특이적 유전자는, 또한 갈색 아디포겐성 유도의 8일 후에 현저하게 증가합니다.
대부분의 NCADSC 격리 프로토콜은 간단하고 경제적이며 항체의 사용을 요구하지 않기 때문에 IFP의 강력한 유체 강도는 FACS 영양 효율을 향상시킬 수 있습니다.
