이 연구에 사용된 MHC I(A4.840) 및 MHCIIa(A4.74)에 대한 항체는 H. M. Blau 박사에 의해 개발되었으며 MHCIIx(6H1)에 대한 항체는 Dr. C. A. Lucas에 의해 개발되었으며 National Institute of Child Health and Human Development의 후원 덕분에 Developmental Studies Hybridoma Bank(DSHB)에서 획득했으며 아이오와 대학교에서 유지 관리했습니다. 생명과학부(아이오와주 아이오와시티). 이 연구를 위해 인체 근육 샘플을 제공한 Victoria L. Wyckelsma에게 감사드립니다. 그림 1의 이미지 대부분은 BioRender.com 에서 가져온 것입니다.
자금: 이 연구는 외부 자금 지원을 받지 않았습니다.

MyDoBID- 근육 섬유 유형을 효율적으로 식별하기 위한 새로운 기술

<ol>
	<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles.">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li><li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat,+mouse,+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis.">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), e35273 (2012).</li><li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+differences+in+the+protein+abundances+of+GAPDH+and+Na(+),K(+)-ATPase+in+skeletal+muscle+from+aged+individuals.">Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals.</a> Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).</li><li>Morales-Scholz, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+type-specific+autophagy+responses+following+an+overnight+fast+and+mixed+meal+ingestion+in+human+skeletal+muscle.">Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).</li><li>Tripp, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+fibre+type-dependent+nature+of+calcium-handling+protein+responses+to+sprint+interval+exercise+in+human+skeletal+muscle.">Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle.</a> The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).</li><li>Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+cell-specific+differences+in+type+2+diabetes.">Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256 (2022).</li><li>Murphy, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+skeletal+muscle+calpain-3+by+eccentric+exercise+in+humans+does+not+result+in+its+translocation+to+the+nucleus+or+cytosol.">Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol.</a> Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).</li><li>Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+technique+to+measure+proteins+in+single+segments+of+human+skeletal+muscle+fibers:+fiber-type+dependence+of+AMPK-alpha1+and+-beta1.">Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1.</a> Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).</li><li>Christiansen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast,+reliable+and+sample-sparing+method+to+identify+fibre+types+of+single+muscle+fibres.">A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6473 (2019).</li><li>Skelly, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+fiber+type-specific+responses+to+sprint+interval+and+moderate-intensity+continuous+exercise:+acute+and+training-induced+changes.">Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes.</a> Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).</li><li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+electrolytes+in+man.">Muscle electrolytes in man.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).</li><li>Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suction+applied+to+a+muscle+biopsy+maximizes+sample+size.">Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size.</a> Medicine &amp; Science in Sports &amp; Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).</li><li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+skeletal+muscle+mitochondrial+content+in+older+adults:+relationship+between+mitochondria,+fibre+type+and+high-intensity+exercise+training.">Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training.</a> The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).</li><li>Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+type+populations+and+Ca2+-activation+properties+of+single+fibers+in+soleus+muscles+from+SHR+and+WKY+rats.">Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).</li><li>Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+considerations+for+protein+analyses+using+antibody+based+techniques:+down-sizing+Western+blotting+up-sizes+outcomes.">Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes.</a> The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).</li><li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains.">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).</li><li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work.">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li></ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

섬유 수집 수년간의 경험을 바탕으로 대부분의 연구원은 이 기술을 마스터할 수 있습니다. 그러나 연습을 통해 다운스트림 분석을 위한 더 빠르고 효율적인 섬유 수집이 가능합니다. 풀링을 위해 품질의 단일 섬유 세그먼트 30개를 분리할 수 있으려면 샘플당 50개의 섬유 세그먼트를 수집하는 것이 좋습니다. 섬유 수집 비디오를 주의 깊게 연구하고 두 번의 연습 세션(세션당 ~50개의...

골격근은 세포(섬유)가 느린 경련(유형 I)인지 빠른 경련(유형 II)인지에 따라 달라지는 뚜렷한 세포 대사 및 수축 특성을 가진 이질적인 조직입니다. 섬유 유형은 수축 시간, 단축 속도 및 피로 저항을 포함하여 여러 면에서 서로 다른 미오신 중쇄(MHC) 동형을 검사하여 식별할 수 있습니다1. 주요 MHC 동형에는 유형 I, 유형 IIa, 유형 IIb 및 유형 IIx가 포함되며 대사 프로파일은 산화(유형 I 및 IIa) 또는 해당작용(IIx, IIb)입니다1. 이러한 섬유 유형의 비율은 근육 유형과 종에 따라 다릅니다. IIb형은 설치류 근육에서 널리 발견됩니다. 인체 근육은 IIb형 섬유를 포함하지 않으며 주로 MHC 동형 I형 및 IIa 섬유로 구성되며 IIx 섬유의 비율은 적습니다2. 단백질 발현 프로파일은 섬유질 유형에 따라 다르며 노화3, 운동4,5 및 질병6에 따라 변경될 수 있습니다.
다양한 골격근 섬유 유형에서 세포 반응을 측정하는 것은 근육 균질화(모든 섬유 유형의 혼합)의 검사로 인해 종종 간과되거나 불가능합니다. 단일 섬유 웨스턴 블롯은 개별 근육 섬유에서 여러 단백질을 조사할 수 있습니다7. 이 방법론은 이전에 균질한 제제를 사용하여 얻을 수 없었던 새롭고 유익한 단일 섬유 특성을 생성하는 데 활용되었습니다. 그러나 원래의 단일 섬유 웨스턴 블롯 방법론에는 시간이 많이 걸리는 특성, 샘플 복제를 생성할 수 없음, 고가의 고감도 ECL(enhanced chemiluminescence) 시약 사용 등 몇 가지 한계가 있습니다. 신선한 조직을 사용하는 경우 이 방법은 제한된 시간(즉, 1-2시간) 내에 개별 섬유를 분리해야 하는 시간 제약으로 인해 더욱 제한됩니다. 다행히도, 이러한 억제는 동결 건조된 조직으로부터 단일 섬유 분절을 분리함으로써 완화된다8. 그러나 동결 건조된 샘플에서 섬유를 수집하는 것은 생검 조직의 크기와 품질에 의해 제한됩니다.
도트 블로팅 방법(dot blotting method)9을 이용한 섬유 유형 식별은 이 포괄적인 프로토콜에서 상당히 정교화되고 확장되었다. 이전에, 2~10 mg의 습식 근육 조직이 동결 건조 및 단일 섬유 MHC 동형 단백질 분석에 적합하다는 것이 입증되었다9. Christensen et al.9은 ~1mm 섬유 세그먼트의 30%를 사용하여 도트 블로팅에 의해 존재하는 MHC 동형을 검출했으며, 이는 웨스턴 블로팅으로 확인되었습니다. 이 연구는 웨스턴 블로팅을 도트 블로팅으로 대체함으로써 전체 비용이 ~40배(50개 섬유 세그먼트의 경우) 감소했음을 보여주었습니다. 그런 다음 섬유를 유형 I 및 유형 II 샘플로 "통합"하여 실험적 복제를 허용했습니다9. 그럼에도 불구하고 한계는 유형 I(MHCI 양성) 및 유형 II(MHCII 양성 섬유)의 두 가지 섬유 유형 특이적 샘플만 획득되었으며 유형 II 샘플에는 MHCIIa와 MHCIIx 6,10의 혼합물이 포함되어 있습니다. 특히, 현재 프로토콜은 순수 IIx 유형 광섬유를 식별하는 방법을 보여주며 일반적인 프로토콜 문제에 대한 문제 해결 전략을 포함하여 매우 상세한 워크플로(그림 1에 요약됨)를 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Denaturing buffer</td>
			<td>Make according to recipe</td>
			<td>Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies</td>
			<td>&#160;1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x Denaturing buffer</td>
			<td>Make according to recipe</td>
			<td>Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors</td>
			<td>3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.&#160; Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>100% ethanol can be sourced from any company</td>
			<td>Diluted to 95% with ultra-pure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160; A2066</td>
			<td>Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scales</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Model number: MSZ042101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody enhancer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>32110</td>
			<td>Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (100 mL)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5452</td>
			<td>Model name: Mini Spin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.</td>
			<td>Diploma</td>
			<td>Store bought</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3</td>
			<td>BSA: Sigma-Aldrich&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>BSA: A6003-25G&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10x PBS: 1610780&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; NaN3: S2002</td>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette opening lever&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>4560000</td>
			<td>Used to open the precast gel cassettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP Imager&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>Model number: Universal hood III</td>
			<td>Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion blotter</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1704070</td>
			<td>Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion Cell (Bio-Rad)</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1656001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL (enhanced chemiluminescence)</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1705062</td>
			<td>Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610772</td>
			<td>Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, 0.34 mm thick</td>
			<td>Whatmann</td>
			<td>3030917</td>
			<td>Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tissue dissecting forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>F6521-1EA</td>
			<td>Jeweller&#8217;s forceps no. 5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat plastic tray/lid&#160;&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-drying System</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750030</td>
			<td>Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 oC&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any freezer with a constant temperature of -80 &#176;C is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel releasers</td>
			<td>1653320</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Slide under the membrane to gather or move the membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grey lead pencil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Image lab software&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1660521</td>
			<td>Any incubator that can be set to 37 &#176;C would suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer with flea</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane roller&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1651279</td>
			<td>Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes&#160; (0.6 mL)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG HRP secondary</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgM HRP secondary</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97230</td>
			<td>Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>A4.840&#160;</td>
			<td>Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>A4.74&#160;</td>
			<td>Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>6H1</td>
			<td>Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane 0.45 &#181;m&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1620115</td>
			<td>For Western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish lid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tweezers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pack&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>164-5050</td>
			<td>Product name: Basic power supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit HRP secondary</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Motic</td>
			<td>SMZ-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripping buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21059</td>
			<td>Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue (lint free)</td>
			<td>Kimberly-Clark professional</td>
			<td>34120</td>
			<td>Product name: Kimwipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)</td>
			<td>TG: Bio-Rad Laboratories&#160;&#160; Methanol: Merck</td>
			<td>TG buffer: 1610771&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Methanol: 1.06018</td>
			<td>dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tray</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1704089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;UV-activation precast gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5678085</td>
			<td>Gel type: 4&#8211;15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer (1x TBST)</td>
			<td>10x TBS: Astral Scientific&#160; Tween 20: Sigma</td>
			<td>&#160;BIOA0027-4L</td>
			<td>1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash containers</td>
			<td>Sistema</td>
			<td>Store bought</td>
			<td>Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fiber type identification of human skeletal muscle

여기에 설명된 기술은 도트 블로팅(dot blotting)을 사용하여 개별 근육 섬유의 세그먼트에서 특정 미오신 중쇄(MHC) 동형을 식별하는 데 사용할 수 있으며, 이하 MyDoBID(Do t Blotting for IDentification of muscle fiber type)에 의한 Myosin 중쇄 검출이라고 합니다. 이 프로토콜은 인간의 골격근을 동결 건조시키고 단일 근육 섬유의 세그먼트를 분리하는 과정을 설명합니다. MyDoBID를 사용하여 유형 I 및 II 섬유는 각각 MHCI 및 IIa 특이적 항체로 분류됩니다. 그런 다음 분류된 섬유는 각 생검을 위해 섬유 유형별 샘플로 결합됩니다.
각 샘플의 총 단백질은 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl-Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 및 UV 활성 겔 기술에 의해 결정됩니다. 섬유 유형의 샘플은 웨스턴 블로팅을 사용하여 검증됩니다. 여러 웨스턴 블롯에서 표적 단백질 검출을 향상시키기 위해 단백질 로딩 정규화를 수행하는 것의 중요성도 설명합니다. 단일 섬유 웨스턴 블롯과 비교하여 분류된 섬유를 섬유 유형별 샘플로 통합하면 시료의 다양성, 시료 처리량 증가, 투자 시간 단축 및 비용 절감 조치의 이점이 있으며, 균질화된 근육 시료를 사용하여 자주 간과되는 중요한 섬유 유형별 정보를 유지할 수 있습니다. 프로토콜의 목적은 동결 건조된 인간 골격근 샘플에서 분리된 유형 I 및 유형 II 섬유를 정확하고 효율적으로 식별하는 것입니다.
이러한 개별 섬유는 이후에 결합되어 유형 I 및 유형 II 섬유 유형별 샘플을 생성합니다. 또한, 프로토콜은 웨스턴 블로팅에 의해 IIx 섬유로 확인된 MHCI 및 MHCIIa에 대해 음성인 섬유에 대한 마커로 Actin을 사용하여 IIx 유형 섬유의 식별을 포함하도록 확장됩니다. 그런 다음 각 섬유 유형별 샘플을 사용하여 웨스턴 블로팅 기법을 사용하여 다양한 표적 단백질의 발현을 정량화합니다.

Skeletal muscle is a heterogeneous tissue, with distinct cellular metabolic and contractile properties that are dependent on whether the cell (fiber) is slow twitch (type I) or fast twitch (type II). The fiber type can be identified by examining the myosin heavy chain (MHC) isoforms, which differ from each other in several ways, including contraction time, speed of shortening, and fatigue resistance1. Major MHC isoforms include type I, type IIa, type IIb, and type IIx and their metabolic profiles are either oxidative (type I and IIa) or glycolytic (IIx, IIb)1. The proportion of these fiber types varies in muscle type and between species. Type IIb is widely found in rodent muscle. Human muscles do not contain any type IIb fibers and consist predominantly of MHC isoforms type I and IIa fibers, with a small proportion of IIx fibers2. Protein expression profiles vary between different fiber types and can be altered with aging3, exercise4,5, and disease6.
Measuring cellular responses in different skeletal muscle fiber types is often overlooked or not possible due to the examination of muscle homogenates (a mix of all fiber types). Single-fiber western blot allows for the investigation of multiple proteins in individual muscle fibers7. This methodology has previously been utilized to produce novel and informative single-fiber characteristics that were not possible to obtain using homogenate preparations. However, there are some limitations of the original single-fiber western blot methodology, including the time-consuming nature, the inability to generate sample replicates, and the use of expensive, sensitive enhanced chemiluminescence (ECL) reagents. If fresh tissue is being used, this method is further limited due to the time constraints of needing to isolate individual fibers within a limited timeframe (i.e., 1-2 h). Fortunately, this restraint is mitigated by isolating single-fiber segments from freeze-dried tissue8. However, fiber collection from freeze-dried samples is limited by the size and quality of the biopsied tissue.
Fiber type identification using the dot blotting method9 has been significantly elaborated upon and expanded in this comprehensive protocol. Previously, it has been demonstrated that as little as ~2-10 mg of wet weight muscle tissue is adequate for freeze-drying and single-fiber MHC isoform protein analysis9. Christensen et al.9 used 30% of a ~1 mm fiber segment to detect the MHC isoform present by dot blotting, which was confirmed by western blotting. This work showed that by substituting western blotting with dot blotting, the overall costs were reduced by ~40-fold (for 50 fiber segments). Fibers were then &#34;pooled&#34; into type I and type II samples, which allowed for experimental replication9. Nevertheless, a limitation was that only two fiber type-specific samples were obtained: type I (MHCI positive) and type II (MHCII positive fibers), with type II samples containing a mixture of MHCIIa and MHCIIx6,10. Notably, the current protocol demonstrates how pure type IIx fibers can be identified and provides a highly detailed workflow (summarized in Figure 1), including troubleshooting strategies for common protocol issues.

저자 스포트라이트: MyDoBID 기법을 사용한 골격근 섬유 유형의 미스터리 해독 

인체 골격근의 섬유 유형 식별

Our research centers around skeletal muscle, which is comprised of cells with distinctive metabolic and contractile properties, characterized as slow or fast twitch fibers. We delve into the factors contributing to these differences and explore their implications in the context of aging, exercise, and various diseases. Measuring cellular responses in different skeletal muscle fibers is often overlooked, or not possible due to the examination of muscle homogenates.The MyDoBID technique allows us to repeatedly analyze fiber type protein differences that were previously impossible to measure. This protocol accurately and efficiently identifies type one and type two muscle fibers from freeze dried human skeletal muscle samples. This newly revised method provides a straightforward approach for researchers to investigate protein differences in skeletal muscle at the cellular level.Notably, it facilitates the identification of type two X fibers, and these have historically been challenging to distinguish. The technique allows researchers to shed light on all fiber types, including the elusive type two X fiber. With the MyDoBID technique, numerous questions can now be answered.For example, one can discover the properties of type two X muscle fibers, and determine if there's evidence indicating preferential atrophy of type two X muscle fibers during aging or disease. One can also observe how a specific exercise intervention impacts each fiber type.

도트 블로팅을 사용한 개별 MHCI, MHCIIa 및 MHCIIx 근육 섬유 식별 MyDoBID의 특징은 주어진 광섬유에서 다양한 MHC 및 Actin 신호 강도 강도를 분류하는 것입니다(그림 4A). 섬유 유형은 MHCI 및 IIa 동형의 존재 유무에 의해 식별되었습니다(그림 4B). 6개의 섬유는 MHC 또는 액틴 검출이 나타나지 않았으며, 이는 수집된 섬유가 없음을 나타냅니다. 이 ?...

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이 프로토콜은 동결 건조된 인간 골격근에서 단일 섬유 분리 및 도트 블로팅 기술을 사용하여 미오신 중쇄(MHC) 동형에 따른 섬유 유형 분류를 보여줍니다. 확인된 MHC I 및 II 섬유 샘플은 웨스턴 블로팅을 사용하여 단백질 발현의 섬유 유형별 차이에 대해 추가로 분석할 수 있습니다.

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot ...

우리의 연구는 느리거나 빠른 경련 섬유를 특징으로 하는 독특한 대사 및 수축 특성을 가진 세포로 구성된 골격근을 중심으로 합니다. 우리는 이러한 차이에 기여하는 요인을 탐구하고 노화, 운동 및 다양한 질병의 맥락에서 그 의미를 탐구합니다. 다양한 골격근 섬유의 세포 반응을 측정하는 것은 종종 간과되거나 근육 균질액 검사로 인해 불가능합니다.MyDoBID 기법을 사용하면 이전에는 측정할 수 없었던 섬유질 유형의 단백질 차이를 반복적으로 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 동결 건조된 인간 골격근 샘플에서 유형 1 및 유형 2 근육 섬유를 정확하고 효율적으로 식별합니다. 이 새로 개정된 방법은 연구자들이 세포 수준에서 골격근의 단백질 차이를 조사할 수 있는 간단한 접근 방식을 제공합니다.특히, 유형 2 X 섬유의 식별을 용이하게 하며, 이는 역사적으로 구별하기가 어려웠습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 찾기 어려운 유형 2 X 섬유를 포함하여 모든 섬유 유형을 밝힐 수 있습니다. MyDoBID 기법을 사용하면 이제 수많은 질문에 답할 수 있습니다.예를 들어, 제2형 X 근섬유의 특성을 발견하고, 노화나 질병 중에 제2형 X 근섬유의 우선적 위축을 나타내는 증거가 있는지 확인할 수 있습니다. 또한 특정 운동 개입이 각 섬유 유형에 어떤 영향을 미치는지 관찰할 수 있습니다.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

1.7K 조회수.  La Trobe University. 우리의 연구는 느리거나 빠른 경련 섬유를 특징으로 하는 독특한 대사 및 수축 특성을 가진 세포로 구성된 골격근을 중심으로 합니다. 우리는 이러한 차이에 기여하는 요인을 탐구하고 노화, 운동 및 다양한 질병의 맥락에서 그 의미를 탐구합니다. 다양한 골격근 섬유의 세포 반응을 측정하는 것은 종종 간과되거나 근육 균질액 검사로 인해 불가능합니다.MyDoBID 기법을 ?...