작은 식민지 변형 또는 SCV 기술은 슈도모나스 아에루기노사의 작은 식민지 변종의 선택과 성장을 허용합니다. 이 방법은 매우 확실하며 일반 방법보다 쉽게 선택할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 표준 비뇨기산 카르바졸 방법에 비해 알지네이트 정량화를 위한 보다 안전하고 민감한 ELISA 방법을 상세히 설명하여 소터리 또는 시료 조작 없이 시료에서 직접 알자능 정량화를 가능하게 한다.
절차를 시연하는 것은 실험실 기술자 인 브랜든 커비와 내 실험실대학원생 인 로이 알 아마르 (Roy Al Ahmar)가 될 것입니다. 작은 식민지 변형 또는 SCV를 검출하기 위해, 먼저 사전 따뜻하게 PIA 플레이트에 P.aeruginosa 변형 PAO1 델타 PYRD를 줄입니다. 48 시간 동안 섭씨 37도에서 균주를 성장시면 됩니다.
성장 판상에서, 일반적인 3~5밀리미터 식민지 크기와 는 반대로 1~ 3밀리미터의 식민지 크기를 특징으로 하는 SCV 표현형을 가지는 단일 식민지 분리를 식별한다. SCV의 순수한 분리를 얻기 위해 선택한 식민지를 다시 줄입니다. 인양 경로의 생리적 활성화를 수행하려면 멸균 접종 루프를 사용하여 PIA 플레이트에서 SCV 콜로니를 선택하십시오.
0.1 밀리몰라 우라실로 보충된 미리 데운 PIA 플레이트에서 선택한 콜로니를 줄입니다. 24 ~48시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 자랍니다. 우론산 카르바졸 분석기를 시작하려면, 멸균 이쑤시개를 사용하여 콜로니를 시험하고 선택하기 위해 원하는 균주의 순수한 배양으로부터 단일 식민지를 식별한다.
PIB의 5 밀리리터를 포함하는 배양 시험 관에 이쑤시개를 놓습니다. 셰이커 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 성장합니다. 인큐베이션을 따라 미리 데워진 PIA 플레이트에 배양된 PIB 국물의 알리쿼트를 넣습니다.
멸균 세포 스프레더를 사용하여 국물을 접시 에 퍼뜨리고 섭씨 37도에서 24 시간 동안 자랍니다. 파이펫 컨트롤러와 멸균 50 밀리리터 파이펫을 사용하여, 어른 잔디에 0.85 %의 염화 나트륨을 추가하고 세포 스프레더를 사용하여 플레이트를 긁어 샘플을 수집합니다. 신선한 50 밀리리터 파이펫을 사용하여 샘플을 흡인하고 50 밀리리터 수집 튜브로 옮킨다.
샘플을 높은 곳에 소용돌이쳐 얼음에 샘플을 섞고 놓습니다. 샘플의 OD600을 측정하려면 먼저 0.85%의 염화나트륨을 사용하여 분광계를 블랭크합니다. 그런 다음 샘플 1 밀리리터를 새로운 일회용 큐벳에 추가하고 OD를 읽습니다. 이 단계를 두 번 반복하여 각 샘플에 대한 트리플리케이트를 얻습니다.
이제 황산 붕산 용액 3 밀리리터를 배양 튜브에 넣고 얼음 위에 앉게 하십시오. 수집된 샘플의 마이크로리터 350을 시험관의 산 혼합물에 천천히 넣습니다. 낮은 에 잠시 소용돌이 후, 산 시료 혼합물에 0.1%의 카바졸 및 에탄올 용액의 100 마이크로리터를 추가합니다.
중간 설정에서 튜브와 소용돌이를 5초 동안 캡합니다. 그런 다음 55°C의 건조한 욕조에 30분간 놓습니다. 인큐베이션 후 튜브를 조심스럽게 소용돌이쳐 5분 동안 식힙니다.
0.85%의 염화나트륨을 가진 튜브를 분광광계에 공백으로 사용하십시오. 그런 다음 깨끗한 큐벳에 혼합물의 1 밀리리터를 추가하고 분광계에서 530 나노미터에서 샘플의 OD를 읽습니다. d-mannuronic 산의 알려진 농도의 직렬 희석의 OD530을 측정하여 표준 곡선을 준비합니다.
두 번 반복하고 이러한 판독값에서 선형 방정식을 추출합니다. 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 알긴네이트 농도를 계산하고 ALginate 농도를 선형 방정식에서 OD600으로 나누어 OD600당 총 알긴네이트양을 얻습니다. 마이크로피펫을 사용하여 수집된 샘플의 50마이크로리터를 처리되지 않은 96웰 플레이트에 추가합니다.
그런 다음 우물에 ELISA 코팅 버퍼 50 마이크로 리터를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 분출 병을 사용하여, 우물을 채우고 접시를 뒤집어 서 그들을 배수하여 PBS-T로 접시 우물을 두 번 세척합니다.
마이크로피펫으로 200마이크로리터의 블로킹 버퍼를 우물에 넣고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 배양합니다. 다음 날, 이전과 같이 PBS-T로 접시를 두 번 씻으시다. 그런 다음 1~2시간 동안 100마이크로리터의 희석된 1차 항체를 우물에 넣고 섭씨 37도에서 배양합니다.
배양 후, 이전과 같이 PBS-T로 플레이트 웰을 세 번 씻으시다. 다음으로, 1~2시간 동안 100마이크로리터의 희석된 이차 항체를 우물에 넣고 섭씨 37도에서 배양한다. 접시를 세 번 다시 세척한 후 마이크로 파이프를 사용하여 TMB ELISA 용액 100 마이크로리터를 추가하십시오.
접시를 서랍에 넣거나 호일로 포장하여 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 플레이트를 배양하십시오. 그런 다음 정지 용액 100 마이크로리터를 추가합니다. 플레이트 판독기를 사용하여 450 나노미터에서 OD를 측정합니다.
d-mannuronic 산의 알려진 농도의 직렬 희석의 OD450을 측정하여 표준 곡선을 생성합니다. 측정값을 두 번 반복하고 선형 방정식을 추출합니다. 표준 곡선을 사용하여 각 샘플에서 알긴의 농도를 계산하고 OD600당 총 알긴네이트양을 얻기 위해 OD600으로 선형 방정식에서 알긴전농도를 나눕니다.
여기에 표시된 PAO581 및 PAO581의 샘플은 PIA및 PIA에서 자란 피리미딘 드 노보 생합성을 조절하는 유전자의 돌연변이를 우라실의 0.1 밀리머로 보충합니다. 데이터는 미디어에 우라실의 존재가 복원 된 alginate 생산에 의해 본 바와 같이 점액으로 돌연변이 변형의 변환을 초래한다는 것을 보여줍니다. 여기서, 항알기네이트 단클론 항체-ELISA에 대한 결과가 나타난다.
식민지는 PBAD 프로모터와 pHERD-20T 플라스미드의 유도를 위해 아라비노스가 있는 PIA 플레이트에서 재배됩니다. 주요 알기네이트 특이적 시그마 인자 알루U를 탑재한 PAO1, PAO1, PAO1은 주요 알기네이트 생합성 효소 GDP-만노스 탈수소효소를 코딩하는 데 있는 algD 유전자의 인프레임 삭제를 갖는다. 이 데이터는 PAO1 및 PAO1 델타 algD에 대해 측정된 알기네이트의 비점액 수준을 pHERD-20T algU와 PAO1에 대해 측정된 알긴네이트의 점막 수준과 비교합니다.
항 알자네이트 ELISA는 또한 플레이트에 대한 사전 성장없이 환자 가래 샘플에서 테스트되었습니다. 점액 P.aeruginosa의 성장을 했다 3 개의 CF 가래 샘플 비 점액 P.aeruginosa 또는 아니 P.aeruginosa 성장을 포함 하는 두 개의 환자 가래 샘플에 비해 검출 알기네이트 를 보였다. 이는 샘플 내에서 알긴산의 정확하고 정확한 측정을 가능하게 하기 때문에 알지네이트 정량화를 위한 표준 곡선의 준비는 매우 중요합니다.
카르바졸 방법에 사용되는 산용액은 매우 위험하므로 적절한 개인 보호 장비와 예방 조치를 사용하여 안전을 보장해야 합니다. SCV를 격리한 후, 추가 유전 프로파일링은 발생하는 돌연변이와 그러한 돌연변이와 관련된 병원성을 더 잘 이해하기 위해 수행 될 수 있습니다. ELISA 방법은 낭포성 섬유증 환자에서 만성 폐 감염을 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.
게다가, 우리의 성장 방법은 특정 SCV에 기인한 감염을 진단하는 것을 도울 수 있었습니다.
