이전에 게시된 RiboTag 메서드를 개선하여 배경을 크게 줄입니다. 따라서 뮤터 시스템과 같은 복잡한 모델에 대한 응용 프로그램이 분석 관점에서 더 간단하고 비용이 많이 듭니다. 실험적인 동물 생성 외에도, RiboTag 방법은 리보솜 관련 mRNA를 분석하는 다른 방법보다 훨씬 쉽고 간단합니다.
모든 RNA 실험과 마찬가지로 엄격한 RNase 무료 조건은 성공을 위한 기본입니다. RNA에 대한 경험이 제한되어 있다면 먼저 기본 RNA 추출을 수행하여 상태를 확인한 다음 계속 진행하십시오. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 로렌 추크랄라 (Lauren Chukrallah)가 될 것입니다.
균질화 완충제를 준비하려면 pH 7.4에서 1개의 어금니 트리 2.5밀리리터, 염화칼륨 1개 의 밀리리터 5개, 해어 마그네슘 염화마그네슘 1개 중 600마이크로리터, MP40 마이크로리터 500마이크로리터를 50밀리리터튜브에 첨가한다. 다이틸 파이로카보네이트 처리물을 튜브에 추가하여 부피를 50밀리리터로 가져오고 모든 성분이 통합될 때까지 섞어드세요. 높은 소금 세척 버퍼를 준비하려면 pH 7.4에서 1 개의 어금니 트리 2.5 밀리리터, 염화 칼륨 1 개 1 개, 해어 마그네슘 염화물 1 개 중 600 마이크로 리터, MP40 마이크로 리터 500 마이크로 리터를 50 밀리리터 튜브에 추가하십시오.
다이틸 파이로카보네이트 처리 물에 50 밀리리터의 부피에 가져와 모든 구성 요소가 통합될 때까지 섞어드십시오. 모든 샘플 튜브의 무게를 미리 측정하고, 무게를 기록하고, 액체 질소에서 미리 식힙니다. 미리 식히는 멸균 박격포, 유봉 및 마른 얼음에 주걱 무게.
그런 다음 드라이 아이스에서 미리 냉각 된 멸균 박격포와 유봉을 사용하여 플래시 냉동 조직 샘플을 큰 조각으로 분해하고 천천히 미세 한 분말로 갈아 냅니다. 미리 냉각된 주걱을 사용하여 박격포에서 분말을 미리 냉각된 수집 튜브로 긁어 가능한 한 건조한 얼음을 유지하십시오. 조직 분말로 튜브의 무게를 측정합니다.
튜브의 무게에서 튜브의 초기 중량을 샘플로 빼서 조직의 질량을 계산합니다. 나중에 리시스 버퍼 볼륨을 계산하기 위해 이 값을 기록합니다. 균질화 완충제 디티오스리톨, RNase 억제제, 사이클로헤시미드, 헤파린 및 1개의 프로테아제 억제제 정제의 10 밀리리터에 첨가하여 용해 완충제를 준비한다.
모든 구성 요소가 통합될 때까지 섞고 사용할 때까지 얼음을 유지합니다. 100밀리그램의 시료에 대해 1밀리리터의 리시스 버퍼를 추가합니다. 용해 버퍼를 추가하는 데 사용되는 동일한 파이펫으로, 신중하게 파이펫 결과 용액을 위아래로 받아 셀을 단편화하고 혼합합니다.
샘플이 더 이상 점성이 없을 때까지 일반적으로 25 ~ 30 스트로크에 대한 파이펫팅을 계속합니다. 얼음에 샘플을 10분 간 설정하여 lyse합니다. 그런 다음 10, 000g에서 10 분 동안 섭씨 4도에서 미리 냉각 된 원심 분리기에서 샘플을 회전시.
큰 느슨한 흐린 펠릿은 튜브 의 바닥에 형성됩니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하고, 새로운 튜브에 용액을 수집하고 각 샘플의 볼륨을 기록합니다. 시료 분해를 방지하기 위해 가능한 한 얼음에 저장하거나 섭씨 4도에 저장 나머지 프로토콜 전체에서 시원하게 유지되도록 하십시오.
지금, 적절한 항체 결합 단백질에 결합된 자기 구슬의 필요한 양을 계산합니다, 단백질 G.lysate의 1 밀리리터를 위해, 밀리리터 당 30 밀리그램에 도달하기 위하여 단백질 G 구슬의 375 마이크로리터를 사용하십시오. 비드 용액을 자기 튜브 랙에 1.7 밀리리터 튜브에 놓습니다. 비드 용매를 제거하고 구슬에 신선한 용해 버퍼의 동일한 볼륨을 추가합니다.
벤치탑 튜브 회전기는 섭씨 4도에서 20 RPM으로 설정되어 튜브를 5분간 회전하여 세척합니다. 자기 튜브 랙에 튜브를 놓고 세척 버퍼를 제거합니다. 세척을 두 번 더 반복한 후 원래 볼륨에 리시스 버퍼를 추가하여 구슬을 양립합니다.
사용 전까지 섭씨 4도 또는 얼음 위에 보관하십시오. lysate의 모든 1 밀리리터에 대해 평형 구슬50 마이크로 리터를 추가하고 한 시간 동안 섭씨 4도에서 회전합니다. 그런 다음 자석 랙에 튜브를 놓고 리세이트를 신선한 튜브에 수집합니다.
사용된 구슬을 폐기합니다. lysate에, 추가 25 모든 밀리 리터에 대 한 평형 구슬의 마이크로 리터를 추가 하 고 1 시간 동안 섭씨 4도에서 회전. 남은 평형 단백질 G 구슬을 섭씨 4도에 하룻밤 동안 저장합니다.
아침에는 튜브를 자석 랙에 놓고 리자테를 신선한 튜브에 모으십시오. 사용된 구슬을 폐기합니다. 클리어된 lysate에서 50마이크로리터를 샘플 입력 컨트롤로 유지합니다.
영하 80도에 보관하십시오. 클리어된 리세이트 1밀리리터당 5마이크로그램의 항하 항체를 추가하십시오. 시료 손실을 방지하기 위해 실험실 필름으로 튜브 캡을 밀봉하고 4°C에서 16~18시간 샘플을 회전시합니다.
클리어리세이트 1밀리리터당 300마이크로리터의 단백질 G 비즈를 넣으세요. 실험실 필름으로 튜브 캡을 다시 밀봉하고 섭씨 4도에서 2 시간 동안 회전합니다. 구슬이 IPed lysate에서 분리할 수 있도록 자석 랙에 샘플 튜브를 놓습니다.
파이펫 오프 흐름-통해 lysate 및 폐기, 구슬을 유지. 구슬에 800 마이크로리터의 고염 세척 버퍼를 추가합니다. 튜브를 회전에 10분간 섭씨 4도에 놓습니다.
샘플 튜브를 자석 랙에 놓고 구슬이 세척에서 분리되도록 합니다. 세척을 제거하고 버리십시오. 구슬에 800 마이크로리터의 고염 세척 버퍼를 추가합니다.
튜브를 닫고 섭씨 4도에서 5분 동안 회전할 수 있습니다. 샘플 튜브를 자석 랙에 놓고 구슬이 세척에서 분리되도록 합니다. 세척을 제거하고 버리십시오.
다시 한 번 세척을 반복합니다. 세척 후, 구슬에 14.2 개의 어금다 베타 메카토에탄올의 3.5 마이크로 리터를 넣고 15 초 동안 소용돌이로 섞습니다. 제조 업체의 지시에 따라 상용 RNA 정제 키트를 사용하여 RNA를 추출합니다.
RNase 무료 물 30 마이크로 리터에서 샘플을 엘테. 샘플을 영하 80도에 보관하십시오. 이 연구에서는, 아주 작은 RNA는 IP 배경을 감소시키고 정품 HA 태그 리보소말 RNA를 격리하기 위하여 이 프로토콜의 효과를 보여주는 Cre 또는 Rpl22HA가 부족한 견본에서 격리되었습니다.
RNA 격리 프로토콜에 있는 일련의 항체는 Cre 및 Rpl22HA 양성 견본에서 시험되었습니다. 이러한 결과는 시약 선택이 IP 효율성에 큰 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다. 리보택 관련 RNA를 분리하는 리보택 시스템의 효과를 검사했다.
야생형 입력 및 IP 유전자형 모두에 대해 입력 농도가 입력 샘플에 RNA가 더 많다는 것을 나타내는 IP 농도보다 상당히 높았다. 총 RNA 풀에서 RNA 무결성 수 값은 10에 가까워질 것으로 예상되었으며, 더 높은 추론된 시료 무결성 및 품질과 상관관계가 높은 RIN이 더 높았습니다. IP 샘플은 입력보다 RIN이 낮았지만, RIN은 여전히 허용 범위 내에 있었으며 시료 유전자형에 의존하지 않았습니다.
RNase 무료 조건을 사육하고 유지하는 것 외에도 연구자들은 제안된 각 샘플을 수집하고 유지해야합니다. 입력 RNA는 특히 여러 유형의 다운스트림 분석의 핵심입니다. 우리의 실험실을 위해, 우리는 일반적으로 면역 침전 후에 RNA 순서를 능력을 발휘합니다.
이를 통해 리보솜 협회를 위해 전체 성적증명서 돔을 쿼리할 수 있습니다. 대안은 마이크로 어레이 분석 또는 정량적인 RT-PCR를 포함할 것입니다. 우리를 위해, 이 시스템은 특정 RNA 결합 단백질의 돌연변이를 가진 리보솜 관련 RNA에 있는 변경을 확인하는 것을 허용합니다.
