Name: mouse- and human-derived primary gastric epithelial monolayer culture for the study of regeneration
Uploaded: 2018-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration at JoVE.com

이 작품은 NIH (NIDDK) 5에 의해 지원 되었다 R01 DK083402-07 부여 (YZ).

오염 방지, 살 균 조직 문화 후드 내에서 전체 프로토콜을 수행 합니다. 승인 된 신시내티 대학 IRB 프로토콜에 따라 소매 위절제술을 받은 환자에서 인간의 fundic 조직 수집 (IRB 프로토콜 번호: 2015-4869). 모든 마우스 연구는 신시내티 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC) 평가의 미국 협회 및 인증의 실험실 동물 배려 (AAALAC) 시설 유지 관리에 의해 승인 되었다.
1. 인간 파생 3D 위 Fundic Organoids 구축
참고:이 프로토콜은 이전이 랩8에 발표 된 연구에 근거한 다.
<ol><li>50 %Wnt 조절 하 고 20 %R-spondin 조절 미디어 구성 된 3D organoid 미디어를 준비 합니다.<ol>
<li>단련 하는 Wnt 미디어 준비, Wnt 성장 매체에 L 셀 문화 (Dulbecco 독수리 매체 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 수정의 페니실린/스) 7 일, 수확, 매체 및 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링.</li>
		<li>R-spondin 조건 미디어를 준비 합니다. R-spondin 성장 매체에서 수정된 HEK 293T R-spondin 은닉 세포 라인을 성장 (Dulbecco 독수리 매체 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 수정의 페니실린/스). 2 시간 후 첨부 파일에 매체에서에서 변경 이러한 셀 OPTIMEM 성장 매체, 1% 페니실린/스. 7 일 동안 세포 문화. R-spondin 조절 미디어 수확 그리고 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링 합니다. 참고:이 프로토콜 이전 게시 되었습니다 및 자세한 프로토콜 6,,78를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>성장 인자 감소, 페 놀 레드 무료 지하실 멤브레인 매트릭스 4 ° c.에 얼음에 16 h에 대 한 해 동 에는 얼음 차가운 캘리포니아2 +/Mg2 +조직 수집-큰 플라스틱 용기에 DBPS 무료. 시작 단계 1.4까지 얼음에 저장 합니다. 참고: 조직 소매 위절제술을 받은 환자에서 수집 됩니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 세척 살 균 비 커 100ml Ca2 +/Mg2 +포함 하에서 적극적으로 조직-Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS) 무료. 세척 약 30 s 또는 파편과 혈액 제거 되었습니다 때까지. 다음, 멸 균 거 즈를 사용 하 여, 상피에서 점액 레이어를 멀리 닦으십시오.</li>
	<li>조직의 힘과 근육 층을 파악, 멀리는 곡선된 hemostatic 포 셉을 사용 하 여 상피를 긁어 단단히 포 셉을 사용 하 여. 살 균, 폴리스 티 렌 페 트리 접시에 긁힌 것된 상피 파편을 수집 합니다.</li>
	<li>상피 조직 조직 소화를 최적화 하기 위해 면도기를 사용 하 여 약 2.0 x 2.0 m m2 크기의 조각으로 말하다. 캘리포니아2 +/Mg2 + 조직 파편을 씻고-DBPS 항생제로 보충 무료 (캘리포니아2 +/Mg2 + -무료 DPBS, 1% 페니실린/스, 0.25 mg/mL 암포 B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL 대) 때까지 세척은 혈액의 무료입니다. 필요한 경우 여러 세척을 수행 합니다. 신중 하 게 폐기물 비 커에 씻어 멸 균 거 즈를 통해 필터링 하 여 세척을 삭제 합니다.</li>
	<li>수집 25 m m 저 어 바와 미리 데워 부 화 미디어 플라스 크 하단 라운드 125 mL 유리에 파편을 씻어 (2 m L-글루타민, 1% 보충 기초 미디어 페니실린/스, 10 mM HEPES 버퍼, 1 mg/mL 콜라 타입 1, 2 mg/mL 세포 배양 학년 소 혈 청 알 부 민). 고무 격 막과 둥근 바닥 플라스 크를 밀봉 하십시오.</li>
	<li>septa에 20 G 척수 바늘을 삽입 하 고 고무 뿌리고와 산소 탱크에 연결. 어떤 오염 물질을 필터링 하려면 필터를 만드는 튜브에 휴지를 삽입 합니다. 낮은에 산소 유출 켭니다. 격 막의 파열을 피하기 위해 septa에 10-15 유출 바늘을 삽입 합니다.</li>
	<li>클램프를 사용 하 여 링 스탠드에 최대 집합을 장악 하 고 37 ° c 30-45 분 동안 저 어 플레이트 보정 물 욕조에 배치. 후 조직 15 분 동안 배양 되어, 천연된 샘에 대 한 시각적으로 부 화 미디어의 50 µ L을 제거 합니다. 선 밀도 또는 하지 않은 경우 추가 5-10 분 동안 떠나 조직 으로부터 분리.</li>
	<li>50 mL을 추가, 부 화 직후 살 균 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 부 화 미디어 또는 외피 혼합물에 직접 붓는 의해 미리 DMEM/F12를가 열.</li>
	<li>4 50 mL 원뿔 튜브로 멸 균 거 즈를 통해 선 혼합물을 필터링 합니다. 추출 된 땀 샘 원뿔 튜브의 하단에 정착 수 있도록 15 분 동안 얼음에 여과 액을 유지 합니다. 수 정착된 동맥 방해, 제거 하 고 상단 표면에 뜨는 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 40 mL을 삭제 하지 않도록 주의 하십시오. 항생제로 보충 하는 DPBS의 10 mL에 나머지 10 mL를 resuspend.</li>
	<li>5 mL 셀 문화 시험관으로 혼합물을 균등 하 게 배포 합니다. 4 ° C에서 65 x g에 5 분 동안 centrifuge 고 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 제거 합니다. 피 펫 또는 200 µ L 넓은 피 펫 팁을 사용 하 여 해 동된 지하실 멤브레인 매트릭스에 선 펠 릿 resuspend 동 질 때까지 섞는다. 참고: 얼음에이 단계를 수행 하 고 혼합 하는 동안 지하실 멤브레인 행렬의 합을 피하기 위하여 결정적 이다. 또한, 그것은 시각적으로 선 밀도 50 µ L에 대 한 샘플링 검사 하는 것이 중요입니다. 최적의 밀도 ~ 70 %confluency입니다.</li>
	<li>다음으로, 지하실 멤브레인 매트릭스 넓은 스쳐 피 펫을 사용 하 여 50 µ L에 선 접시. 도금 하는 동안 모든 거품을 생성 하지 마십시오.</li>
	<li>37 ° c.에 10-15 분 동안 품 어 유해를 지하실 멤브레인 매트릭스를 허용 하려면 12 잘 문화 접시에 도금 하는 경우 추가 hFGO 미디어의 1 mL (고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 0.25 mg/mL 암포 B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL 대, 10 mM HEPES 버퍼, 1 m m n-Acteylcystine, 1 x N2, B27, Wnt 조절 매체 50%, 20% R spondin 조절 매체 100 ng/mL으로 보충 1 뼈 morphogenetic 단백질 억제제, 1 nM gastrin, 50 ng/mL 표 피 성장 인자, 200 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 10, 10 니코틴, 및 10 µ M Y-27632 바위 억제제) 잘 당. 그렇지 않으면 12-잘 문화 접시를 사용 하 여 추가 지하실 멤브레인 매트릭스 거품 잠수함 충분 한 미디어.</li>
	<li>5% CO2 습도 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 문화. 모든 4-5 일 미디어를 변경 합니다.</li>
</ol>2. 마우스 파생 3D 위 Fundic Organoids 구축
참고:이 프로토콜은 이전에 게시 6되었습니다. 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스를 해 동 하 고 시작 하기 전에 모든 시 약 준비.
<ol><li>연구 수행 되 고 있는 연구 기관에 의해 승인 메서드를 사용 하는 쥐를 희생. 마우스에서 위를 제거 하 고 이전에 게시 프로토콜 6따라 해 부. 20 mL 얼음 차가운 캘리포니아2 +/Mg2 +세척-DBPS 무료. 참고: C57BL/6 마우스, 세 8-10 주 fundic 위 organoid 문화에 대 한 사용 됩니다. 쥐 위 제거 하기 전에 수동 경부 전위 뒤 이산화탄소의 흡입에 의해 안락사 되었다.</li>
	<li>위장에서 근육 층을 제거 하 고 모든 보이는 혈관 이전 6출판.</li>
	<li>동굴에서 살 균 면도날을 사용 하 여 forestomach는 저를 구분 합니다. 작은 수술가 위를 사용 하 여 파편 약 2.0 x 2.0 m m. 집게를 사용 하 여에 컷된 저 EDTA 인큐베이션 버퍼를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 파편을 수집 (캘리포니아2 +/Mg2 +-무료 DPBS, 5 mM EDTA)와 함께 2 h 4 ° C에서 품 어 부드러운 동요입니다.</li>
	<li>살 균 후드, 원뿔 관 두고 그대로 조각 가능한 많은 외피 버퍼를 제거 하는 피 펫을 사용 하는 약 5 분에 대 한 얼음 조각. 추가 버퍼를 떨고 5 mL (1 g D-솔 비 톨, 100 ml Ca2 +/Mg2 +1.47 g 자당-DPBS 무료) 2 분 허용 정착 하 고 서둘러, 1000 p 피 펫을 사용 하 여 제거 아직 정착 해야 작은 조각 큰 조각 힘으로 손으로 흔들어 상위 계층.</li>
	<li>65 x g에서 4 ° C에서 5 분 동안 제거 조각 회전.</li>
	<li>공기 거품을 피하 면 서,는 상쾌한을 제거 하 고 지하실 멤브레인 매트릭스에 resuspend 때까지 균질 성 혼합.</li>
	<li>넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 잘 당 50 µ L에서 지하실 멤브레인 매트릭스 접시와 다음 20 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>충분 한 mFGO 성장 매체 추가 (고급 Dulbecco의 수정이 글 매체/F12 매체 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 10mm 보충 HEPES 버퍼, 1 m m n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50 %Wnt 조절 매체, 20% R spondin 조절 매체와 100 ng/mL 뼈 morphogenetic 단백질 억제제, 10 nM gastrin, 50ng/mL 표 피 성장 인자, 10 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 10, 10 µ M Y-27632 바위 억제제 보충) 거품 잠수함.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 습도 셀 문화 인큐베이터에서 세포 문화. 모든 4-5 일 미디어를 변경 합니다.</li>
</ol>3. 콜라겐 코팅 2D 전송
참고: 별도로 지정 하지 않는 한 무 균 조직 문화 후드에 모든 절차를 수행 합니다. 콜라겐은 단층을 3D organoids를 전송 하기 전에 24 시간 코팅을 시작 합니다. 얼음에 쥐 꼬리 콜라겐을 유지 하 고 빛 으로부터 차폐 된. 콜라겐 코팅 접시는 최대 2 주에 대 한 좋은. 코팅된 접시를 즉시 사용 하지, 경우 랩 parafilm 및 필요한 때까지 4 ° C에서 저장소 접시.
<ol><li>쥐 꼬리 콜라겐 20 m m 초 산을 사용 하 여 50 µ g/mL로 희석.</li>
	<li>충분히 희석된 콜라겐과 우물의 표면 커버. 표준 12-잘 접시에 한 잘, 콜라겐의 약 1 mL와 함께 코트. 살 균 후드에 실 온에서 하룻밤 둡니다.</li>
	<li>캘리포니아2 +/Mg2 +1 mL로 두 번 세척-DPBS 잘 당 고 떠나 살 균 후드에 실 온에서 2 h에 대 한 발견.</li>
</ol>4. 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 2D 전송
참고: 별도로 지정 하지 않는 한 무 균 조직 문화 후드에 모든 절차를 수행 합니다. 지하실 막 매트릭스 2 h는 단층을 3D organoids를 전송 하기 전에 코팅을 시작 합니다. 얼음에 지하실 멤브레인 매트릭스를 유지. 코팅된 판 즉시 사용할 수 있으며 시간의 오랜된 기간 동안 저장할 수 없습니다.
<ol><li>지하실 막 매트릭스 셀 문화 학년 물 15 mL 원뿔 튜브에 1:10 희석 비율. 얼음에 희석.</li>
	<li>표준 12-잘 접시의 각 잘 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스의 100 µ L를 추가할는 피 펫을 사용 하 여. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 균등 하 게도 코트 잘 걸쳐 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스를 배포 합니다.</li>
	<li>1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 잔여 물을 제거 하 고 3D organoids를 전송 하기 전에 1 시간 실 온에서 건조.</li>
</ol>5. 2D 위 상피 세포 Monolayers 3D m/hFGOs의 전송
<ol><li>후 3D 마우스-또는 인간-파생 된 FGOs에 6-7 일에 대 한 교양 있다, 2D 단층을 3D organoids의 전송을 시작 합니다. 참고: 필요한 단층의 각 잘이 좋습니다 300 그대로 organoids 또는 300 organoids에서 파생 된 단일 셀을 사용 하 여. 강력한 문화에서 그것 약 150 organoid/잘 12 잘 문화 배지 내의 얻을 예정 이다.</li>
	<li>접시는 전송 하기 전에 코팅 해야 합니다. 그러나 참고: 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 접시 반투명 젤 레이어,, 콜라겐 코팅 판 코팅의 어떤 명백한 표시 없는 것입니다.</li>
	<li>직접 pipetting 1 mL 균 캘리포니아2 +/Mg2 +여 접시에서 3D 지하실 멤브레인 매트릭스 거품을 꺼내-거품의 중심에 DBPS 무료.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여, 셀 문화 테스트 튜브로 지하실 멤브레인 매트릭스, organoid 혼합물을 수집 합니다. 튜브 당 2 지하실 멤브레인 매트릭스 거품의 비율로 수집 합니다. 40 x g와 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기</li>
	<li>진공 시스템을 사용 하 여 제거는 상쾌한 그리고 최대한 많은 지하실 멤브레인 매트릭스. 캘리포니아2 +/Mg2 +4 ml에서 resuspend-무료 DBPS, 상쾌한를 제거 하 고 2-3 회 반복. 전체 organoid 전송 프로토콜에 대 한 5.10 단계로 진행 합니다. 5.7 단일 셀 서 스 펜 션 프로토콜에 대 한 단계를 계속 합니다.</li>
	<li>37 ° C에 세포 분리 솔루션을 미리 따뜻한 고 각 시험관에 1 mL를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 반전 하거나 한 피 펫으로 아래로 pipetting으로 혼합. 37 ° c.에서 10 분 동안 품 어</li>
	<li>캘리포니아2 +/Mg2 +의 2 개 mL를 추가-각 테스트 튜브에 직접 DBPS 무료.</li>
	<li>26 G 바늘을 사용 하 고 주사기는 혼합 2-3 번. 시각적으로 하나의 셀에 대 한 확인 합니다. Organoids 또는 셀의 클러스터는 여전히 1-2 번 더 주사기.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 40 x g에서 원심 분리기 2D FGO 미디어에 펠 릿을 resuspend (2D 마우스 FGO 성장 매체: 고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 m L-글루타민, 10mm 페니실린/스, 10% 태아 종 아리 혈 청, 10 mM HEPES 버퍼, 1 x N2, 1 x B27, 10 nM gastrin, 50 ng/mL 표 피 성장 인자, 1 µ M TGF-β 억제제와 10 µ M Y-27632 바위 억제제 보충. 2D 인간의 FGO 성장 매체: 고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 10 mM HEPES 버퍼, 10% 태아 종 아리 혈 청, 10mm 니코틴, 1 x N2, 1 x B27, 50 mg/mL 대, 50 ng/mL 상피 성장으로 보충 요인, 그리고 10 µ M Y-27632 바위 억제제, 1 µ M TGF-β 억제제).</li>
	<li>코팅된 판에 물의 resuspension 플레이트입니다. 37 ° c.에 번호판을 품 어 교체 미디어 매 4 일 또는 이전 미디어 노란색. 단층 형태로 약 4 일이 필요합니다.</li>
</ol>6. 스크래치 상처 분석 결과 2D 위 상피 세포 Monolayers를 사용 하 여
<ol><li>문화에는 100 %confluency 도달 했습니다 때 면도날을 사용 하는 단층 스크래치.</li>
	<li>실 온에서 15 분 동안 3.7% 포름알데히드를 사용 하 여 monolayers를 수정 합니다. 실 온에서 20 분 동안 0.5% 비 이온 세제/PBS와 permeabilize.</li>
	<li>다음 실 온에서 1 h에 대 한 혈 청 2% 당나귀와 monolayers를 차단 하 고 H+, K+의 1:1000 희석을 품 어-ATPase 1 차적인 항 체 하룻밤 4 ° C에서 0.1% 비 이온 세제/PBS로 세척 및 당나귀의 1: 100 희석으로 품 어 반대로 마우스 488 이차 항 체 및 10μg/mL Hoechst 세포 핵의 실 온에서 1 시간을 위한 얼룩.</li>
	<li>2D 인간 파생 위 단층 문화에 표면 점액 핏 셀을 확인 하려면 셀 20 μ g /mL Ulex europaeus (UEAI) FITC 켤레의 얼룩. 이미지는 confocal 현미경에 monolayers.</li>
	<li>상처 마다 몇 h. 스크래치 것입니다 다시는 단층의 품질에 따라 24-48 h와 환자 사이 사이 epithelialize의 이미지를 가져가 라.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagy, T. 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저자는 공개 없다.

현재 프로토콜 세부 인간 및 마우스 파생 된 위 상피 monolayers 스크래치 상처 분석 실험을 위해 사용 될 수 있는 설립. 프로토콜 주민 줄기 세포 주 인간 (또는 마우스)에서 절연 조직의 개념에 의존 하 고는 수정 된 프로토콜 처음 발행 Schlaermann 외7. 특히, 우리는 합칠 확립 여기 프로토콜을 최적화 하 고 어떤 표현 주요 세포 계보 vivo에서위 상피 내에서 찾을 수 있는 ?...

처음 상처 분석 실험의 사용 수리 및 재생1,2,,34,,56공부에 대 한 인기 있는 방법입니다. 특별히 위 중생과 헬리코박터 파일로리 식민지 연구 제안 된 방법론을 사용할 수 있습니다. 과거에는, 위 암 세포 선 헬리코박터 파일로리 (헬리코박터) 감염1,2 를 공부 하는 수단으로 사용 되었습니다 했으며 최근 위 암까지 AGS 셀 등 셀 라인 선호1 ,2,,34. 위 암 세포 배양의 한계가 정리 위 상피의 세포 다양성에 그들의 실패 이다. 이 한계를 해결 하려고 하 시연 설립 및 기본 인간 및 마우스 파생 3 차원 fundic 위 organoids (FGOs)의 이동은 여기 먼저 수정 된 방법에 따라 상처 치유 분석 실험에 대 한 위 상피 단층을 Schlaermann 외에의해 설명. 7 위 상피 monolayers에서 파생 된 전단 3D 위 FGOs 또는 단일 셀 FGO 파생 된 유지 밀접 하 게 위 상피의 나타내는 편광된 세포 구성 시연 vivo에서. 위 암 셀 라인 팬 들은이 기술을 표시 셀 구성의 정보를 입증 하지 않습니다, 그는 현재 프로토콜 대체 스크래치 상처 분석 방법에 비해 장점이 있다. 이 방법론은 해리 organoids에서 단일 세포 현 탁 액 또는 전체 organoids에서 설립 하 고 지하실 멤브레인 매트릭스를 사용 하 여 도금 또는 콜라겐 코팅 monolayers 수 면 최적화 되었습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 organoid 파생 된 위 상피 단층 문화 소설 상처 치유 분석 결과 대 한 설정입니다.

<table><tbody><tr><td>Advanced Dulbecco&#039;s modified Eagle/F12 medium (basal media)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-glutamine)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B/Gentamicin</td><td>Thermo Scientific</td><td>R01510</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>RO1510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>n-Acetylcystine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>BMP Inhibitor (Noggin)</td><td>Pepro Tech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Pepro Tech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK Inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta; Inhibitor</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; -free DPBS</td><td>Fisher</td><td>21-031CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>FBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22&amp;micro;M filter</td><td>Fisher</td><td>099-720-004</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C Water Bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 1</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LS004214</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes (tissue paper)</td><td>Fischer Scientific</td><td>06-666C</td><td></td></tr><tr><td>125 mL round bottom flask</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 in (25 mm) stir bar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubber Septa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Gauze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stir Plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ring Stand</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ring Stand Clamps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile petri dish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 G needles of 1.5 in length</td><td>Thermo Fisher</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20 G spinal needles of 3.5 in length</td><td>Thermo Fisher</td><td>405182</td><td></td></tr><tr><td>12-well cell culture treated plate</td><td>Midwest Scientific</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Growth Factor Reduced, Phenol Red-free Matrigel&lt;sup&gt;TM &lt;/sup&gt;(Basement membrane matrix)</td><td>Fisher</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Razor Blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wide-tip tweezers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Curved Hemostatic Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L wide pipette tips</td><td>Thermo Fisher</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>5 mL cell culture test tubes</td><td>Fisher</td><td>14-956-3C</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen Tank with rubber hosing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g D-Sorbitol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>SS-500</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Tray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rocking Table</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat Tail Collagen Type 1</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture grade glacial acetic acid</td><td>Fisher</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture grade water</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>2-well chamber slide</td><td>Thermo Fisher</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>12-well Transwell (polyester membrane inserts)</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (cell detachment solution)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>26&lt;sup&gt;3/8&lt;/sup&gt; G syringe</td><td>Thermo Fisher</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L Cells</td><td>L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands).&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T Rspondin secreting cells</td><td>A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children&#039;s Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA&amp;nbsp;).&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HK-ATPase Primary Antibody</td><td>Invitrogen</td><td>SC-374094</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherinn</td><td>SantaCruz</td><td>sc-59778</td><td></td></tr><tr><td>UEA1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37114</td><td></td></tr></tbody></table>

mouse- and human-derived primary gastric epithelial monolayer culture for the study of regeneration

위 상처 복구의 생체 외에서 연구는 일반적으로 세포질 확산 및 마이그레이션의 스크래치 상처 분석 결과에서 위 암 세포 라인의 사용을 포함 한다. 그러나 이러한 분석의 한 가지 중요 한 한계는, 그들의 균질 성 다양 한 세포 종류입니다. 복구는 여러 종류의 세포 상호 작용을 요구 하는 복잡 한 프로세스입니다. 따라서, 세포 하위, 없는 문화 공부를 우리가 복구 프로세스를 이해 하 고 있다면 극복 되어야 하는 관심사 이다. 위 organoid 모델에 의하여 세포 유형의 이기종 컬렉션 밀접 하 게 위 상피 또는 다른 기본 조직 비보의 반영이 문제를 완화 수 있습니다. 여기는 소설, 스크래치 상처 시험 생체 외에서 인간에서 파생 된 증명 또는 마우스 3 차원 organoids 다음으로 옮겨질 수 위 상피 단층 중 그대로 organoids 또는의 단일 세포 현 탁 액으로는 해리 organoids입니다. 프로토콜의 목적은 organoid 파생 된 위 상피 monolayers 위 재생 연구 소설 스크래치 상처 분석 결과 시스템에서 사용할 수 있는 설정입니다.

Organoids는 인간의 코 퍼스/본문 또는 마우스 위 조직 (그림 1A)의 저에서 파생 되었다. 콜라 또는 인간 또는 마우스 파생 된 위장 조직의 EDTA 소화 후 각각 샘 지하실 멤브레인 매트릭스에 포함 되며 6-7 일 (그림 1A)에 대 한 교양. 그림 1B 인간 파생 위 organoids (huFGOs) 다음 위 상피 단층 (huGEM)로 지하실 멤브레인 ...

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Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

여기는 설정 하 고 2 차원 단층을 3D organoids의 전송에 대 한 인간 및 마우스 파생 된 3 차원 (3D) 위 organoids, 그리고 방법을 경작 하는 프로토콜에 설명 합니다. 재생 연구에 대 한 분석 결과 처음 상처를 소설로 위 상피 단층의 사용은 또한 기술 된다.

중생의 연구에 대 한 기본 위 상피 단층 문화 마우스 및 인간의 파생

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

mouse-human-derived-primary-gastric-epithelial-monolayer-culture-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K 조회수.  University of Cincinnati. 여기는 설정 하 고 2 차원 단층을 3D organoids의 전송에 대 한 인간 및 마우스 파생 된 3 차원 (3D) 위 organoids, 그리고 방법을 경작 하는 프로토콜에 설명 합니다. 재생 연구에 대 한 분석 결과 처음 상처를 소설로 위 상피 단층의 사용은 또한 기술 된다.

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Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. Although there are many established gastric cancer cell lines and many conventional transgenic mouse models for preclinical research, the disadvantages of these in vitro and in vivo models limit their applications. Because the characteristics of these models have changed in culture, they no longer model tumor heterogeneity, and their responses have not been able to predict responses in humans. Thus, alternative models that better represent tumor heterogeneity are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models preserve the histologic appearance of cancer cells, retain intratumoral heterogeneity, and better reflect the relevant human components of the tumor microenvironment. However, it usually takes 4-8 months to develop a PDX model, which is longer than the expected survival of many gastric patients. For this reason, establishing primary cancer cell lines may be an effective complementary method for drug response studies. The current protocol describes methods to establish PDX models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. These methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

The current protocol describes methods to establish patient-derived xenograft (PDX) models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. The methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

연구

암 연구학

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

면역학 및 감염병학

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates such as fish, MG-driven regeneration occurs naturally; in mammals, however, stimulation with certain factors or genetic/epigenetic manipulation is required. Since MG comprise only 5% of the retinal cell population, there is a need for model systems that allow the study of this cell population exclusively. One of these model systems is primary MG cultures that are reproducible and can be used for a variety of applications, including molecule/factor screening and identification, testing of compounds or factors, cell monitoring, and/or functional tests. This model is used to study the potential of murine MG to convert into retinal neurons after supplementation or inhibition of microRNAs (miRNAs) via transfection of artificial miRNAs or their inhibitors. The use of MG-specific reporter mice in combination with immunofluorescent labeling and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) confirmed that 80%-90% of the cells found in these cultures are MG. Using this model, it was discovered that miRNAs can reprogram MG into retinal progenitor cells (RPCs), which subsequently differentiate into neuronal-like cells. The advantages of this technique are that miRNA candidates can be tested for their efficiency and outcome before their usage in in vivo applications.

M&#252;ller glia primary cultures obtained from mouse retinas represent a very robust and reliable tool to study the glial conversion into retinal progenitor cells after microRNA treatment. Single molecules or combinations can be tested before their subsequent application of in vivo approaches.

MicroRNA 처리 후 Murine Müller Glia의 재생 잠재력을 연구하기 위한 일차 세포 배양

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

발생학

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

A Preclinical Human-Derived Autologous Gastric Cancer Organoid/Immune Cell Co-Culture Model to Predict the Efficacy of Targeted Therapies

Tumors expressing programmed cell death-ligand 1 (PD-L1) interact with programmed cell death protein 1 (PD-1) on CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) to evade immune surveillance leading to the inhibition of CTL proliferation, survival, and effector function, and subsequently cancer persistence. Approximately 40% of gastric cancers express PD-L1, yet the response rate to immunotherapy is only 30%. We present the use of human-derived autologous gastric cancer organoid/immune cell co-culture as a preclinical model that may predict the efficacy of targeted therapies to improve the outcome of cancer patients. Although cancer organoid co-cultures with immune cells have been reported, this co-culture approach uses tumor antigen to pulse the antigen-presenting dendritic cells. Dendritic cells (DCs) are then cultured with the patient's CD8+ T cells to expand the cytolytic activity and proliferation of these T lymphocytes before co-culture. In addition, the differentiation and immunosuppressive function of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) in culture are investigated within this co-culture system. This organoid approach may be of broad interest and appropriate to predict the efficacy of therapy and patient outcome in other cancers, including pancreatic cancer.

<meta charset="utf8"></head><body>표적 치료제의 효능을 예측하기 위한 전임상 인간 유래 자가 위암 오가노이드/면역 세포 공동 배양 모델

The goals of the protocol are to use this approach to 1) understand the role of the immunosuppressive gastric tumor microenvironment and 2) predict the efficacy of patient response, thus increasing the survival rate of patients.

표적 치료제의 효능을 예측하기 위한 전임상 인간 유래 자가 위암 오가노이드/면역 세포 공동 배양 모델

Tumors expressing programmed cell death-ligand 1 (PD-L1) interact with programmed cell death protein 1 (PD-1) on CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) to ...

의학

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for 25 min. Human esophageal resection specimens are stripped of muscularis propria and adventitia and the remaining mucosa is minced, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for up to 6 hr. Cultured cells express &#945;-SMA and vimentin and express desmin weakly or not at all. Culture conditions are not conducive to growth of epithelial, hematopoietic, or endothelial cells. Culture purity is further confirmed by flow cytometric evaluation of cell surface marker expression of potential contaminating hematopoietic and endothelial cells. The described technique is straightforward and results in consistent generation of non-hematopoieitc, non-endothelial stromal cells. Limitations of this technique are inherent to the use of primary cultures in molecular biology studies, i.e., the unavoidable variability encountered among cultures established across different mice or humans. Primary cultures however are a more representative reflection of the in vivo state compared to cell lines. These methods also provide investigators the ability to isolate and culture stromal cells from different clinical and experimental conditions, allowing comparisons between groups. Characterized esophageal stromal cells can also be used in functional studies investigating epithelial-stromal interactions in esophageal disorders.

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

마우스 및 인간의 식도에서 근섬유 아세포의 분리

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

생물학

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

장 내분비 세포의 굿 호르몬 분비의 연구 및 라이브 세포 이미징을위한 의도 된 쥐 소장의 혼합 차 문화

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

장 내 토굴에서 뮤린 기본 결장 상피 단층의 세대

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Generation and Characterization of Murine Oral Mucosal Organoid Cultures

The mucous lining covering the inside of our mouth, the oral mucosa, is a highly compartmentalized tissue and can be subdivided into the buccal mucosa, gingiva, lips, palate, and tongue. Its uppermost layer, the oral epithelium, is maintained by adult stem cells throughout life. Proliferation and differentiation of adult epithelial stem cells have been intensively studied using in vivo mouse models as well as two-dimensional (2D) feeder-cell based in vitro models. Complementary to these methods is organoid technology, where adult stem cells are embedded into an extracellular matrix (ECM)-rich hydrogel and provided with a culture medium containing a defined cocktail of growth factors. Under these conditions, adult stem cells proliferate and spontaneously form three-dimensional (3D) cell clusters, the so-called organoids. Organoid cultures were initially established from murine small intestinal epithelial stem cells. However, the method has since been adapted for other epithelial stem cell types. Here, we describe a protocol for the generation and characterization of murine oral mucosal organoid cultures. Primary epithelial cells are isolated from murine tongue tissue, embedded into an ECM hydrogel, and cultured in a medium containing: epidermal growth factor (EGF), R-spondin, and fibroblast growth factor (FGF) 10. Within 7 to 14 days of initial seeding, the resulting organoids can be passaged for further expansion and cryopreservation. We additionally present strategies for the characterization of established organoid cultures via 3D whole-mount imaging and gene-expression analysis. This protocol may serve as a tool to investigate oral epithelial stem cell behavior ex vivo in a reductionist manner.

<meta charset="utf8"></head><body>쥐 구강 점막 오가노이드 배양의 생성 및 특성화

We present a method for the generation and characterization of oral mucosal organoid cultures derived from the tongue epithelium of adult mice.

쥐 구강 점막 오가노이드 배양의 생성 및 특성화

The mucous lining covering the inside of our mouth, the oral mucosa, is a highly compartmentalized tissue and can be subdivided into the buccal mucosa, ...

중생의 연구에 대 한 기본 위 상피 단층 문화 마우스 및 인간의 파생

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위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

MicroRNA 처리 후 Murine Müller Glia의 재생 잠재력을 연구하기 위한 일차 세포 배양

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

표적 치료제의 효능을 예측하기 위한 전임상 인간 유래 자가 위암 오가노이드/면역 세포 공동 배양 모델

표적 치료제의 효능을 예측하기 위한 전임상 인간 유래 자가 위암 오가노이드/면역 세포 공동 배양 모델

마우스 및 인간의 식도에서 근섬유 아세포의 분리

장 내분비 세포의 굿 호르몬 분비의 연구 및 라이브 세포 이미징을위한 의도 된 쥐 소장의 혼합 차 문화

장 내 토굴에서 뮤린 기본 결장 상피 단층의 세대

쥐 구강 점막 오가노이드 배양의 생성 및 특성화