저용량 환기 배양 시스템의 초기 개발은 미국 국립과학재단(National Science Foundation, CRI-OA-1416690, Dickinson College)의 지원을 받았습니다. Lauren Mullineaux 박사는 친절하게도 Woods Hole Oceanographic Institution의 실험실 시설을 제공했으며, 이곳에서 이 시스템에 대해 제시된 데이터(그림 4)를 수집했습니다.

1. C. fornicata의 유충 배양을 확립하고 유지하기 위한 일상적인 기동
참고: 이 방법은 방금 부화한 벨리거 유충을 방출한 성인 C. fornicata 가 들어 있는 바닷물 한 병(3.8L)으로 시작합니다. 성인은 현장에서 수집하거나 재료 표에 제공된 공급 업체로부터 얻을 수 있습니다. 성인은 짝짓기 스택에 사는 protandrous hermaphrodites이며 스택의 맨 아래에 고착 된 암컷이 있습니다. 성인 스택을 분해하지 마십시오. 번식의 계절성과 계절이 아닌 산란을 위해 성충을 조절하는 방법은 이전에 설명되었다17. 유충은 방출 후 2-3시간 이내에 가장 잘 수집되며, 이때 유충은 지리 음성이 강하고 항아리 표면 근처에 집중됩니다.
<ol><li>400mL 삼중 모서리 일회용 플라스틱 비커의 바닥을 자르고 236μm 나일론 메쉬 패널에 붙여서 체를 만듭니다. 이러한 목적과 특히 중우주 건설(아래)을 위해 폴리에틸렌에 대한 접착력이 우수하도록 제조된 핫멜트 접착제를 사용하십시오.</li>
	<li>성인 항아리에서 통기를 제거하고 파편이 가라앉고 유충이 표면으로 쉽게 헤엄칠 수 있도록 15-20분 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>60-80cm 길이의 부드러운 플라스틱 수족관 끝에 부착 된 5mm 유리관의 짧은 길이 (15-20cm)를 통해 유충을 위와 같이 준비된 체에 넣고 600mL 유리 비커에 매달아 과도한 바닷물이 유리 비커를 넘치고 유충은 체에 남아 있습니다. 체의 바닥을 수중에 유지하고 유충이 좌초되지 않도록 하십시오.</li>
	<li>비커에서 체를 잠시 들어 올리고 여과된 해수(FSW)가 담긴 분출 병을 사용하여 저전력 해부 현미경으로 조작할 수 있는 편리한 크기의 FSW 유리 그릇에 유충을 헹굽니다. 참고 : C. fornicata의 유충은 30 ppt 염도 근처의 여과 된 자연 해수 또는 20-25 ° C17,18에서 32 ppt의 염분으로 만들어진 인스턴트 오션 인공 해수에서 번성합니다. < 1μm에서의 여과는 실험실 배양에서 문제를 일으킬 수 있는 오염성 유행성 원생생물을 제거하기에 충분합니다.</li>
	<li>파스퇴르 피펫을 사용하여 원하는 수의 유충을 수동으로 옮기고 배양 용기에 넣습니다. 최상의 결과를 얻으려면 C. fornicata에 대해 1 유충/5 mL 배양 부피를 사용하십시오. 유충의 수를 세고 숫자를 추정하려는 유혹을 피하십시오.</li>
	<li>배양이 시작될 때 원하는 비율의 미세조류를 유충에게 먹이고 배양수를 교체할 때 이틀에 한 번씩 미세조류를 교체합니다. 참고: 1 x 105 cells/mL Isochrysis galbana (균주 T-ISO)의 식단은 거의 최대 실험실 성장률을 산출하는 좋은 표준 식단입니다. T-ISO의 배양을 위한 식품 배급 및 방법은 이전 간행물17에 제공되어 있다.</li>
	<li>위의 1.3단계와 같이 배양액의 내용물을 비커 안의 체에 부어 이틀에 한 번씩 배양수를 교체합니다. 체를 들어 올리고 FSW 분출 병을 사용하여 유충을 새 식품과 함께 신선한 FSW 배양 용기에 헹굽니다. 알림: 가장 좋은 방법은 유충 배양에 사용되는 모든 유리 제품을 분리하고 해당 유리 제품이 고정제, 용해성 중금속염 또는 세제와 접촉하지 않도록 하는 것입니다. 일상적인 청소는 베이킹 소다(NaHCO3) 페이스트와 나일론 수세미를 사용하는 것이 가장 좋으며, 미네랄 침전물은 백식초나 희석된 HCl로 약산성 세척으로 제거할 수 있습니다.</li>
</ol>2. C. fornicata의 유충에 대한 환기 배양 구축
알림: 권장되는 유리 용기(재료 표)에는 해수에 불활성이고 환기 가스 흐름을 위해 튜브 미늘 입구를 고정하는 데 적합한 두께의 폴리프로필렌 뚜껑이 있습니다.
<ol><li>각 배양 용기의 뚜껑(뚜껑의 내부 라이너 포함)에 각각 가장자리에서 약 1.5cm, 서로 마주보고 있는 두 개의 5mm 구멍을 뚫습니다. (13/64인치 영국식 또는 #7 ASME 표준 기계공의 드릴 비트도 적절한 여유 구멍을 만듭니다.)</li>
	<li>뚜껑의 외부 표면에 튜브 미늘이 있는 상태에서 1-8 나일론 너트를 사용하여 10/32 x 32-1 나사산 나일론 튜브 어댑터를 각 구멍에 설치합니다.</li>
	<li>튜빙 어댑터 중 하나의 나사산 내부 부분의 구멍에 실리콘 고무 수족관 실런트를 살짝 바르고 튜빙 미늘의 외부 구멍 너머로 몇 mm 돌출되도록 내부에서 구멍을 통해 20cm 길이의 2mm(외경) 폴리에틸렌 튜브를 밀어 넣습니다.</li>
	<li>튜브는 이제 튜브 미늘을 통해 돌출된 끝에 작은 수족관 밀봉 플러그가 있지만 미늘 끝 바로 너머에서 투명한 튜브를 볼 수 있습니다. 실런트가 경화되도록 한 다음 폴리에틸렌 튜브의 돌출된 끝을 잘라 튜브 미늘의 끝과 같은 높이가 되도록 합니다.</li>
	<li>배양 용기에 FSW를 용기 상단의 어깨에서 1cm 이내로 채우고 뚜껑을 나사로 조인 다음 환기 공기 또는 실험용 가스 혼합 공급 장치를 폴리에틸렌 환기 튜브를 고정하는 튜브 미늘에 부착합니다. 환기 튜브의 길이를 잘라 끝이 용기 바닥에 깔끔하게 놓이도록 합니다.</li>
	<li>환기 공기 또는 가스 혼합물의 흐름을 조정하여 기포가 천천히 생성되도록 합니다(그림 1). 일반적인 수족관 갱 밸브와 함께 수족관 공기 펌프를 사용하여 주변 공기를 환기시키거나 다른 실험용 대기 가스 혼합물에 질량 유량 컨트롤러를 사용하십시오14.</li>
</ol>3. C. fornicata의 유충에 대한 현장 배치 가능한 중우주 배양 구축
<ol><li>표준 4갤런 폴리에틸렌 양동이의 측면에서 각각 25cm x 14.5cm의 균일한 간격의 직사각형 개구부 7개를 자릅니다. 각 개구부의 바닥을 양동이 내부 바닥에서 약 3.5cm 떨어진 곳에 배치합니다(그림 2A). 가는 톱니가 있는 날이 있는 휴대용 전기 세이버 톱이 이러한 목적에 이상적입니다. 잘라낸 쓰레기 조각은 그대로 두고 테이블쏘로 2cm 너비의 스트립으로 세로로 자릅니다.</li>
	<li>양동이의 컷아웃 개구부가 편안하게 겹치도록(최소 2cm) 각각 최소 30cm x 20cm인 236μm 나일론 메쉬 패널 4개를 잘라냅니다. 작은 스프링 클램프 또는 빨래집게를 사용하여 컷아웃의 긴 가장자리 위에 메쉬 패널의 한쪽 가장자리를 임시로 고정합니다.</li>
	<li>폴리에틸렌용으로 제조된 핫멜트 접착제로 철망 패널의 가장자리를 버킷 입구에 붙입니다. 첫 번째 가장자리가 고정되면 장력을 유지하면서 다른 가장자리를 접착제로 붙여서 메쉬 패널에 팽팽한 표면을 얻습니다.</li>
	<li>3.1 단계에서 버킷 폐기물 조각의 스트립 길이를 잘라 철망 패널이 버킷 개구부와 겹치는 접착 영역을 깔끔하게 덮을 수 있도록 보강 스트립을 만듭니다. 넉넉한 양의 핫멜트 접착제로 각 덮개 스트립을 제자리에 누르고 접착제가 굳기 전에 각 스트립을 제자리에 고정하기 위해 빠르게 작업합니다.</li>
	<li>버킷 외부에서 설치된 나일론 블라인드 리벳으로 각 스트립의 끝을 고정합니다. 다용도 면도칼로 보강 스트립의 바깥쪽 가장자리에서 과도한 접착제와 메쉬를 잘라냅니다. 알림: 각 리벳에는 15/64인치 파일럿 구멍이 필요합니다. 리벳의 내부(블라인드) 부분은 그림 2B에서 완성된 중간우주의 내부에서 볼 수 있습니다.</li>
	<li>양동이의 상단을 물 위로 잘 유지하는 부동 랙에 mesocosm을 배치합니다(그림 2C). 표시된 플로팅 랙은 2인치 Schedule 40 PVC 파이프의 30cm 세그먼트로 만들어졌으며 엘보우 및 티 조인트와 함께 접합되어 4개의 복제 중간우주 행을 수용할 수 있는 밀폐 구조를 만들었습니다.</li>
	<li>국부적으로 조건에 따라서, 철망판은 mesocosm를 통해서 바닷물의 교환을 방해하는 방식으로 1-2 일에서 더럽게 될지도 모릅니다. 이런 일이 발생하는 정도까지, 오염된 중간우주를 물 밖으로 2/3정도 빼내고 2L 투수로 바닥에서 신선한 중간우주로 반복적으로 빠져나와 유충을 신선하고 깨끗한 중간우주로 옮깁니다.</li>
	<li>대부분의 유충을 옮기기 위해 20-25 회 반복을 수행하거나 오염 된 중우주에서 유충이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 수행하십시오. 베이킹 소다(NaHCO3) 페이트를 적신 부드러운 스폰지로 메쉬 패널을 부드럽게 문질러 오염된 중간우주를 청소하고 수돗물로 헹굽니다.</li>
</ol>

실험실 및 현장 조건에서 Crepidula fornicata 의 유충 배양

<ol>
	<li>Conklin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryology+of+Crepidula:+a+contribution+to+the+cell+lineage+and+early+development+of+some+marine+gastropods.">The embryology of Crepidula: a contribution to the cell lineage and early development of some marine gastropods.</a> Gasteropods. , (1897).</li><li>Henry, J. J., Collin, R., Perry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slipper+snail,+Crepidula:+an+emerging+lophotrochozoan+model+system.">The slipper snail, Crepidula: an emerging lophotrochozoan model system.</a> Biol Bull. 218 (3), 211-229 (2010).</li><li>Lyons, D. C., Henry, J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carryover+effects+of+brooding+conditions+on+larvae+in+the+slipper+limpet+Crepidula+fornicata.">Carryover effects of brooding conditions on larvae in the slipper limpet Crepidula fornicata.</a> Mar Ecol Prog Ser. 643, 87-97 (2020).</li><li>Noisette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+encapsulation+protect+embryos+from+the+effects+of+ocean+acidification?+The+example+of+Crepidula+fornicata.">Does encapsulation protect embryos from the effects of ocean acidification? The example of Crepidula fornicata.</a> PLoS One. 9 (3), e93021 (2014).</li><li>Kriefall, N. G., Pechenik, J. A., Pires, A., Davies, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resilience+of+Atlantic+slippersnail+Crepidula+fornicata+larvae+in+the+face+of+severe+coastal+acidification.">Resilience of Atlantic slippersnail Crepidula fornicata larvae in the face of severe coastal acidification.</a> Front in Mar Sci. 5, 312 (2018).</li><li>Bogan, S. N., McMahon, J. B., Pechenik, J. A., Pires, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legacy+of+multiple+stressors:+Responses+of+gastropod+larvae+and+juveniles+to+ocean+acidification+and+nutrition.">Legacy of multiple stressors: Responses of gastropod larvae and juveniles to ocean acidification and nutrition.</a> Biol Bull. 236 (3), 159-173 (2019).</li><li>Pechenik, J. 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(eds) Developmental biology of the sea urchin and other marine invertebrates.</a> Methods Mol Biol. 1128, 35-44 (2014).</li><li>Bashevkin, S. M., Pechenik, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interactive+influence+of+temperature+and+salinity+on+larval+and+juvenile+growth+in+the+gastropod+Crepidula+fornicata+(L.).">The interactive influence of temperature and salinity on larval and juvenile growth in the gastropod Crepidula fornicata (L.).</a> J Exp Mar Biol Ecol. 470, 78-91 (2015).</li><li>Strathmann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reproduction and Development of Marine Invertebrates of the Northern Pacific Coast: Data and Methods for the Study of Eggs, Embryos, and Larvae. , (1987).</li><li>Clark, H. R., Gobler, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+fluctuations+in+CO2+and+dissolved+oxygen+concentrations+do+not+provide+a+refuge+from+hypoxia+and+acidification+for+early-life-stage+bivalves.">Diurnal fluctuations in CO2 and dissolved oxygen concentrations do not provide a refuge from hypoxia and acidification for early-life-stage bivalves.</a> Mar Ecol Prog Ser. 558, 43114 (2016).</li><li>Gobler, C. J., Baumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+acidification+in+ocean+ecosystems:+coupled+dynamics+and+effects+on+marine+life.">Hypoxia and acidification in ocean ecosystems: coupled dynamics and effects on marine life.</a> Biol Lett. 12 (5), 20150976 (2016).</li><li>Pechenik, J. A., Hilbish, T. J., Eyster, L. S., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+larval+and+juvenile+growth+rates+in+two+marine+gastropods,+Crepidula+plana+and+C.">Relationship between larval and juvenile growth rates in two marine gastropods, Crepidula plana and C.</a> fornicata. Mar Biol. 125, 119-127 (1996).</li><li>Padilla, D. K., McCann, M. J., McCarty Glenn, M., Hooks, A. P., Shumway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+food+on+metamorphic+competence+in+the+model+system+Crepidula+fornicata.">Effect of food on metamorphic competence in the model system Crepidula fornicata.</a> Biol Bull. 227 (3), 242-251 (2014).</li><li>Wallace, R. B., Baumann, H., Grear, J. S., Aller, R. C., Gobler, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coastal+ocean+acidification:+the+other+eutrophication+problem.">Coastal ocean acidification: the other eutrophication problem.</a> Estuarine, Coast Shelf Sci. 148, 1-13 (2014).</li></ol>

보고해야 할 이해 상충이 없습니다.

C. fornicata의 유충은 다른 플랑크토영양성 해양 유충에 비해 상대적으로 배양이 쉽지만, 좋은 배양 관행의 기본에 대한 관심은 여전히 필수적이다17,19. 건강한 유충은 부화 직후에 먹이를 먹기 시작해야 합니다. 이것은 부화 다음 날에 조류 세포로 가득 찬 전체 내장을 투과 조명이 있는 해부 현미경을 사용하여 관찰함으로써 쉽게 확인할 수 있습?...

슬리퍼 절름발이, Crepidula fornicata (복족류 : Calyptraeidae)는 발달 모델로서의 유용성과 침입 종으로서의 광범위한 영향으로 인해 현재 및 역사적 연구 문헌에 잘 표현되어 있습니다. 이는 고전적 실험발생학(experimental embryology)1 시대에 나선형 발달의 기초적인 사례였으며, 로포트로코조아(lophotrochozoan)의 초기 발달 메커니즘을 해부하기 위해 현대 이미징 및 게놈 도구를 적용함으로써 관심의 재탄생을 경험했다 2,3. 그것의 생명 역사의 다른 쪽 끝에서, 다른 조사는 북아메리카 동부의 원래 분포에서 멀리 떨어진 온대 연안 해양 환경에서 이 생태계 공학자의 성인 개체군의 영향에 초점을 맞추었습니다 4,5. 배아와 성충 사이에서, 이 종의 벨리거 유충은 유충 발달 및 생태학에 대한 수많은 연구의 대상이었으며, 특히 성장과 변태 능력 획득에 영향을 미치는 요인, 유충 정착을 매개하는 내부 및 외부 신호, 유충 경험이 유년기 수행에 미치는 영향 6,7,8,9,10,11 . 최근 연구는 해양 산성화에 대한 C. fornicata의 유충과 청소년의 회복력을 밝혀냈으며,이 동물의 생산적인 연구 사용을위한 또 다른 방법은 12,13,14,15,16입니다.
해양 유충 생물학 연구를위한 C. fornicata 의 장점은 편모 Isochrysis galbana의 단일 식단으로 자연 또는 인공 해수에서 실험실에서 비교적 쉽게 자랄 수 있다는 것입니다. 배양 방법은 저자가 이전에 출판한 방법 중심의 인쇄 간행물17에서 자세히 설명했다. 현재 기부하는 이유는 두 가지입니다. 첫째, 문화를 확립하고 돌보는 것과 관련된 일상적인 신체적 움직임은 개념적으로는 매우 간단하지만 실습이나 비디오 시연 없이는 올바르게 수행하기 어렵습니다. 둘째, 해양 산성화, 부영양화 및 산소 고갈과 같은 환경 스트레스 요인에 대한 반응에 대한 실험실 및 현장 연구에 특히 적합한 앞서 설명한 배양 방법의 두 가지 변형이 설명됩니다. 첫 번째는 소량의 기포 가스를 통해 해수의 pH 및 용존 산소를 조작하는 데 적합한 저용량(800mL) 배양 시스템이고, 두 번째는 현장에 배치할 수 있고 주변 해수를 자유롭게 교환할 수 있는 더 큰 부피(15L) 중간우주 시스템입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bucket, Polyethylene, 7 gallon</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>16916</td>
			<td>for mesocosm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crepidula fornicata</td>
			<td>Marine Biological Laboratory, Marine Resources Center</td>
			<td>760</td>
			<td>adult broodstock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotmelt glue, Infinity Supertac 500</td>
			<td>Hotmelt.com</td>
			<td>INFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LB</td>
			<td>good for bonding polyethylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jar, glass, 32 oz, with polypropylene lid</td>
			<td>Uline</td>
			<td>S-19316P-W</td>
			<td>for 800 mL ventilated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh, 236 &#181;m</td>
			<td>Dynamic Aqua Supply Ltd.</td>
			<td>NTX236-136</td>
			<td>for mesocosm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, hex, nylon, 10-32 thread</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>1004554441</td>
			<td>for fastening tubing barbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivets, nylon, blind, 15/64&#34; diameter, 5/32&#34;-5/16&#34; grip range, pack of 8</td>
			<td>NAPA auto parts</td>
			<td>BK 6652844</td>
			<td>4 packs needed per mesocosm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing barb 1/8&#34; x 10-32 thread</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>65593</td>
			<td>2 needed per culture jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, polyethylene, 2.08 mm OD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-11G</td>
			<td>for ventilating gas stream inside culture jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Tygon, 1/8&#34;x3/16&#34;x1/32&#34;</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>57810</td>
			<td>fits barbs for ventilating cultures</td>
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	</tbody>
</table>

laboratory and field culture of larvae of the slipper limpet, crepidula fornicata

꽃받침 복족류 연체 동물, Crepidula fornicata는 유충 발달 생물학, 생리학 및 생태학 연구에 널리 사용되었습니다. 이 종의 육화된 벨리거 유충은 성충에 의해 자연 방출된 후 체에 사이펀하여 수집하고, 200/L의 밀도로 배양에 배포하고, 1 x 105 cells/mL의 Isochrysis galbana(균주 T-ISO)를 공급했습니다. 주변 공기 또는 정의된 대기 가스 혼합물에 대한 평형을 위해 설계된 환기가 가능한 800mL 배양에서 사육된 형제 유충에 대해 껍질 성장 및 변태 능력 획득이 문서화되었습니다. 이러한 실험실 배양 조건과 대조; 성장 및 역량 데이터는 또한 생식 가능한 성인의 현장 개체군에 위치한 15L 유동 주변 해수 중간우주에서 사육된 유충에 대해 수집되었습니다. 실험실 배양에서 변성 능력의 성장 속도 및 시기는 이전에 발표된 연구에서 보고된 것과 유사했습니다. 현장에서 자란 유충 중우주는 실험실 연구에서 보고된 것보다 훨씬 더 빨리 성장하고 더 빨리 변태했습니다. 이러한 방법은 실험실에서 미리 결정된 통제된 조건뿐만 아니라 현장에서 자연적으로 발생하는 조건 하에서 유충 발달을 탐색하는 데 적합합니다.

The slipper limpet, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), is well-represented in current and historical research literature because of its utility as a developmental model and because of its widespread impacts as an invasive species. It served as a foundational example of spiralian development in the classic age of experimental embryology1 and has experienced a rebirth of interest with the application of modern imaging and genomic tools to dissect mechanisms of lophotrochozoan early development2,3. At the other end of its life history, other investigations have focused on the impacts of adult populations of this ecosystem engineer in temperate coastal marine environments far removed from its original distribution in eastern North America4,5. In between embryo and adult, the veliger larvae of this species have been subjects of numerous studies of larval development and ecology, especially of factors influencing growth and acquisition of competence for metamorphosis, the internal and external cues mediating larval settlement, and the effects of larval experience on juvenile performance6,7,8,9,10,11. Recent studies have revealed the resilience of larvae and juveniles of C. fornicata to ocean acidification, yet another avenue for productive research use of this animal12,13,14,15,16.
An advantage of C. fornicata for studies of marine larval biology is that it is relatively easy to grow in the laboratory in natural or artificial seawater on a unialgal diet of the flagellate Isochrysis galbana. Culture methods have been detailed by the author in an earlier methods-focused print publication17. The reasons for the present contribution are twofold. First, the routine physical maneuvers involved in establishing and caring for cultures are conceptually very simple but difficult to perform correctly without hands-on or video demonstration. Second, two variations on previously described culture methods are described that are especially suited to laboratory and field studies of responses to environmental stressors such as ocean acidification, eutrophication, and oxygen depletion. The first of these is a low-volume (800 mL) culture system suited for manipulation of pH and dissolved oxygen in seawater via small volumes of bubbled gases, and the second is a larger volume (15 L) mesocosm system that can be placed in the field and that allows free exchange of ambient seawater.

저자 스포트라이트: Bridging the Gap Between Field Observations and Lab Manipulations in Larval Ecology Research (유충 생태학 연구에서 현장 관찰과 실험실 조작 사이의 격차 해소)

Slipper Limpet, Crepidula fornicata의 유충의 실험실 및 현장 배양

I'm interested in how the development of marine larvae is influenced by multiple environmental factors and stressors and how the larval nervous system integrates information from the environment to regulate settlement of larvae, metamorphosis to benthic juveniles, and recruitment into adult populations. Larvae of some marine species like the Slipper Limpet, Crepidula Fornicata, are quite resilient to ocean acidification, but there are important interactions between acidification and other factors, like nutrition and salinity. We don't know very much about how larvae grow, develop, and behave in nature.Field mesocosm observations can fill in some of these gaps and suggest hypotheses to test with lab manipulations. We can begin to ask on neurobehavioral, developmental, and transcriptional levels how larvae deal with stressors that vary on short time scales in productive coastal environments that are especially susceptible to human impacts.

유충 성장 및 변태 능력 획득은 800mL 환기 배양물의 4회 동시 복제에서 측정되었으며, 각 배양에는 단일 알 덩어리에서 부화한 유충의 형제 배치에서 파생된 160마리의 유충이 포함되어 있으며 1 x 105 cells/mL의 밀도로 Isochrysis galbana를 공급했습니다. pH는 7.9-8.0, 온도는 20-21 °C, 염도는 30-31 ppt였습니다. 600마리의 유충을 포함하는 15L 중우주의 단일 시험에서 유충의 다른 형제 배치로 성?...

Read this Scientific Article Protocol about Laboratory and Field Culture of Larvae of The Slipper Limpet, Crepidula fornicata at JoVE.com

이 논문은 복족류 Crepidula fornicata 의 유충 배양 방법을 소량의 실험실 규모 시스템과 현장에 배치할 수 있는 주변 해수 중우주 시스템에서 제시합니다.

The calyptraeid gastropod mollusk, Crepidula fornicata, has been widely used for studies of larval developmental biology, physiology, and ecology. Brooded ...

저는 해양 유충의 발달이 다양한 환경 요인과 스트레스 요인에 의해 어떻게 영향을 받는지, 그리고 유충 신경계가 환경의 정보를 통합하여 유충의 정착, 저서 청소년으로의 변태 및 성인 개체군으로의 모집을 조절하는 방법에 관심이 있습니다. Slipper Limpet, Crepidula fornicata와 같은 일부 해양 종의 유충은 해양 산성화에 매우 탄력적이지만 산성화와 영양 및 염도와 같은 다른 요인 사이에는 중요한 상호 작용이 있습니다. 우리는 유충이 자연에서 어떻게 성장하고, 발달하고, 행동하는지에 대해 많이 알지 못합니다.현장 중간우주 관측은 이러한 격차 중 일부를 메우고 실험실 조작으로 테스트할 가설을 제안할 수 있습니다. 우리는 신경 행동, 발달 및 전사 수준에서 유충이 특히 인간의 영향에 취약한 생산적인 해안 환경에서 짧은 시간 규모로 변화하는 스트레스 요인을 어떻게 처리하는지 질문하기 시작할 수 있습니다.

laboratory-field-culture-larvae-slipper-limpet-crepidula

Research

JoVE Journal

Biology

Laboratory and Field Culture of Larvae of The Slipper Limpet, Crepidula fornicata

220 조회수.  Dickinson College. 저는 해양 유충의 발달이 다양한 환경 요인과 스트레스 요인에 의해 어떻게 영향을 받는지, 그리고 유충 신경계가 환경의 정보를 통합하여 유충의 정착, 저서 청소년으로의 변태 및 성인 개체군으로의 모집을 조절하는 방법에 관심이 있습니다. Slipper Limpet, Crepidula fornicata와 같은 일부 해양 종의 유충은 해양 산성화에 매우 탄력적이지만 산성화와 영양 및 염도와 같은 다른 요...

비디오: 저자 스포트라이트: Bridging the Gap Between Field Observations and Lab Manipulations in Larval Ecology Research (유충 생태학 연구에서 현장 관찰과 실험실 조작 사이의 격차 해소)

The calyptraeid gastropod mollusk, Crepidula fornicata, has been widely used for studies of larval developmental biology, physiology, and ecology. Brooded veliger larvae of this species were collected by siphoning onto a sieve after natural release by adults, distributed into the culture at a density of 200/L, and fed with Isochrysis galbana (strain T-ISO) at 1 x 105 cells/mL. Shell growth and acquisition of competence for metamorphosis were documented for sibling larvae reared in ventilated 800 mL cultures designed for equilibration to ambient air or to defined atmospheric gas mixtures. Contrasting with these laboratory culture conditions; growth and competence data were also collected for larvae reared in a 15 L flow-through ambient seawater mesocosm located in a field population of reproductive adults. Growth rates and timing of metamorphic competence in the laboratory cultures were similar to those reported in previously published studies. Larvae reared in the field mesocosm grew much faster and metamorphosed sooner than reported for any laboratory studies. Together, these methods are suited for exploring larval development under predetermined controlled conditions in the laboratory as well as under naturally occurring conditions in the field.

The paper presents methods for larval culture of the gastropod Crepidula fornicata in a small-volume laboratory-scale system and in an ambient-seawater mesocosm system that can be deployed in the field.

연구

생물학

Collection of Larvae of Crepidula fornicata for Laboratory and Field Cultures

To begin, stop the aeration of the jar containing the adult Crepidula fornicata. Let the jar stand for 15 to 20 minutes to allow for debris sedimentation. Next, fix a short length of five millimeter wide glass tubing to a soft plastic aquarium tubing.Once the larvae swim up, place a sieve over a 600 milliliter glass beaker, then siphon the larvae through the tubing into the sieve. Lift the sieve briefly, invert it and squirt filtered sea water on the bottom of the sieve to rinse the larvae into a glass bowl with filtered sea water.

실험실 및 현장 배양을 위한 Crepidula fornicata 의 유충 수집

Construction of Ventilated Cultures for Larvae of Crepidula fornicata

To begin, drill two five millimeter holes in lid of jar. Install a tubing barb in each hole using a 10-32 nylon nut. Apply a dab of silicone rubber aquarium sealant on the aperture of the threaded inner portion of a tubing barb.Push a 20 centimeter long, two millimeter wide polyethylene tubing through the aperture. Allow the sealant at the end of the tubing to cure, then trim the protruding end, so that it is flush with the end of the tubing barb.

Crepidula fornicata의 유충에 대한 환기 배양 건설

Setup and Routine Maintenance of Laboratory Cultures of Crepidula fornicata

To begin, place a glass bowl containing the larvae of Crepidula fornicata on the stage of a dissecting microscope. With a Pasteur pipette, manually transfer and count the desired number of larvae into a culture jar containing filtered sea water. Feed the larvae with an appropriate volume of microalgae.Add filtered sea water to bring the culture volume to within one centimeter of the shoulder of the jar. Screw down the lid of culture jar and connect the ventilation air supply to the barb fitting on the tubing leading to the jar's bottom. Use an aquarium air pump with common aquarium gang valves to supply ventilation with ambient air.Then adjust the air flow to yield a steady, slow stream of bubbles. To replace the culture water, pour the contents of the jar into a sieve over a beaker. Invert the sieve over the culture jar containing fresh, filtered sea water, then use a squirt bottle of filtered sea water to rinse the larvae into the jar.Add some microalgae as feed for the larvae and top off the jar with filtered sea water to within one centimeter of the jar's shoulder. The larvae of Crepidula fornicata appear to grow slower in the laboratory cultures relative to the mesocosm cultures. The larvae started to metamorphos by day eight, and were all competent for metamorphosis by day 12.

Crepidula fornicata의 실험실 배양 설정 및 일상적인 유지 관리

Field-Deployable Mesocosm Culture of the Larvae of Crepidula fornicata

To begin, use a handheld electric saber saw to cut four evenly spaced rectangular openings into the sides of a standard 7 gallon polyethylene bucket. With a table saw, slice the cutout pieces lengthwise into 2 centimeter wide strips. Cut out four panels of nylon mesh to overlap the cutout openings of the bucket.Temporarily secure one edge of a mesh panel over the long edge of a cutout with small spring clamps. Now glue the edge of the mesh panel to the bucket opening with hot glue. Once the first edge is fastened, glue down the other edges while maintaining a top tension on the panel.Next, trim down the ends of the cutout pieces so that they fit over the glued area of the panel. Press each covering strip in place with a liberal amount of hot melt glue. Finally, secure the end of each strip with a nylon blind rivet installed from outside the bucket.Use a utility razor to trim the excess glue and mesh from the edges of the reinforcing strips. The larvae of Crepidula Fornicata appeared to grow faster in the mesocosm relative to the laboratory cultures. The larvae metamorphose spontaneously between the fifth and sixth day.Almost all the larvae had metamorphosed by day seven.