The authors would like to thank all the members of the "Insect Genetics and Genomics" Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1. 실험 셋업 <ol><li> Insectary 요구 사항 <ol><li> 모든 C. 유지 capitata 수명은 25 ° C, 65 % 습도와 12/12 시간 빛 / 어둠 광주에서 스테이지. </li><li> 6 L 케이지 약 1,500-2,000 medfly 번데기를 놓습니다. 산란 (42)을 자극하기에 충분 작은 구멍 한쪽에 메쉬 황동 케이지를 사용합니다. 모세관 작용에 의해 물과 파리를 제공하기 위해 케이지의 기본에 작은 구멍을 통해 스폰지 스트립을 삽입합니다. 성인 (그림 1A)를위한 음식 소스로 효모와 설탕 (1시 10분)의 혼합물을 사용합니다. 효모의 양을 증가 (최대 1 : 설탕 : 3, 효모) 암컷이 알을 낳기에 실패합니다. </li><li> 메시을 통해 퇴적 된 계란을 수집 케이지 아래에 물이 가득 접시를 놓습니다. 처녀 암컷이 알을 낳다 수 있듯이 파리는 미세 주입 실험에 계란을 수집하기 전에 적어도 6~7일 나이가 될 때까지 기다립니다. 이 여성이 성관계를 한 것을 보장합니다그리고 계란은 수정 된 된 것입니다. </li><li> 미세 그물 여과기로 물을 필터링하여 계란을 수집합니다. 표준 애벌레 식품 (1.5 LH 2 O, 100 ml의 염산 1 %를 포함하는 플라스틱 상자에 스트레이너에서 계란을 이동 광범위 항균제가 50 ml의 에탄올 5g, 400g 설탕 175g 순수 맥주의 효모, 1 파스퇴르 피펫을 사용하여) 소프트 밀기울을 kg이다. </li><li> 공기 순환을 허용 순 뚜껑 폐쇄 투명 용기에 각 창을 배치하고 밀기 층을 함유 번데기 (도 1b)을 선호. </li><li> 약 10 일 후, 애벌레 음식에서 등장과 번데기의 쌀겨 층 아래로 뛰어 3 차 령 유충을 확인합니다. </li><li> 24 시간 후, 부드러운 브러시를 사용하여 작은 컵에서 번데기를 수집하고 새로운 성인 케이지로 전송. 성인은 일반적으로 십일 번데기 후 등장. 신흥 비행은 ptilinum, 일 위의 머리에있는 팽창 주머니를 사용안테나의 전자베이스는 puparium의 끝을 강제로. 출현 후, ptilinum 영구적으로 다시 내 머리 축소합니다. </li></ol></li><li> 마이크로 인젝션 유충 1 L 식품의 제조 <ol><li> 300 ML의 H 2 O 2.5 g 한천을 녹이고 </li><li> 따뜻한 500㎖의 H 2 핫 교반 접시에 O 및 4g 나트륨 안식향산 염을 용해, 4.5 ml의 37 % 염산, 42g 효모 추출물과 115g 탈수 당근 분말. </li><li> 상기 혼합물에 10 mL의 무수 에탄올에 용해 된 2.86 g 광범위 항균제의 용액을 추가한다. </li><li> 배양 접시 라운드 15cm의 매체를 배포하고 냉각 할 수 있습니다. 필요한 경우, 4 ℃에서 저장. </li></ol></li><li> 슬라이드 준비 <ol><li> 현미경 슬라이드 (75 X 26mm 2)에 양면 테이프의 2cm 스트립을 놓고 중국 마커 가장자리를 표시, 기름 확산과 주입 된 배아의 필연적 인 탈수를 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li><st룽&gt; 핵산 준비 <ol><li> 시판 키트 (34)를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다. 에탄올을 사용하여 플라스미드를 석출 원하는 농도로 주입 버퍼 (0.1 mM의 포스페이트 버퍼 pH 7.4, 5 mM의 KCl을)에 재현 탁. </li><li> 페놀 - 클로로포름을 사용하여 긴 dsRNA를 synthetized 체외에서 정화, 이소프로판올을 사용하여 침전 및 사출 버퍼 (43)에 다시 일시 중지합니다. </li></ol></li></ol> 2. 배아 준비 <ol><li> 6-7일 옛 성인을 포함하는 케이지 아래에 물이 가득 트레이를 배치합니다. </li><li> 암컷은 30 분 동안 알을 낳다하고 정밀한 스트레이너를 사용하여 물을 필터링하여 배아를 수집 할 수 있습니다. 항상 배아 탈수를 방지하기 위해 물에 스트레이너를 유지합니다. </li><li> 상업 50 % 표백제 용액에 5 초 동안 여과기를 immerging하여 배아를 Dechorionate. </li><li> 반복 적어도 (깨끗한 초순수에 스트레이너를 immerging 조심스럽게 배아를 씻으4-5 회). 마지막으로, 깨끗한 초순수에 여과기를 배치합니다. 최대 2 시간 이내에 배아를 사용합니다. 주 : 마이크로 인젝션의 타이밍이 종래 cellularization 핵 분열의 단계에서, 사전 배반 배아 내로 주입의 필요성에 관한 것이다. 이렇게 주입 된 DNA가 권취되는 핵 내로, 특히 생식을 발신한다 원시 생식 세포 핵에 있습니다. medfly cellularization 9 및 12 시간 45, 46 사이에 일어난 반면, 초파리에서 극 세포에서 cellularization는 배반 엽의 형성은 약 30 분 후에 44 발생으로 수정 후 약 90 분에 (25 ° C에서)를 시작합니다. </li><li> 행 배아 방향 <ol><li> 좋은 붓을 사용하여, 약 50 배아를 수집하고 물에 담가 검은 필터 종이의 디스크에 배치합니다. </li><li> 해부 실체 현미경, 양면 테이프의 상면에 행 배아를 마련미세 브러시 (000)를 사용하여 현미경 슬라이드 (도 1C). 참고 : 분사가 세균 줄 발생한 것 극부에서 수행 될 때, 모두 같은 방향으로 배아를 맞 춥니 다; 후방 극은 micropyle 영역에 반대입니다. </li><li> 클로로 기름의 층이 석유는 중국 마커 테두리 (1.3 참조)를 통해 유출되지 않도록하기와 배아를 커버. 참고 : 오일 배아를 피복하기 전에, 추가의 단계가 수행 될 수있다 : 배아는 액체 함량을 감소시키고 이에 따라 주입 DNA 용액의 진입을 용이하게하기 위해 몇 분 동안 건조 된 수있다. 이것은 높은 액체 압력의 결과로서, 주사 또는 주입 용액의 과다 유출시 배아 붕괴를 방지 할 수있다. </li></ol></li></ol> 3. 배아 미세 주입 <ol><li> 플라스미드 DNA 또는 마이크로 피펫을 사용하여 dsRNA를 용액 (1-2 μg의 / μL)와 바늘 (1-2 μL)를 입력합니다. </li><l난&gt; 주입 시간 (0.5 초)를 제어하는 ​​마이크로 인젝션 장치에 바늘을 연결, 압력 (800 고전력 증폭기)와 배압 (150 고전력 증폭기). </li><li> 바늘 (도 1D)의 움직임을 제어하는 미세 조작기를 사용하여 실체 현미경 하에서 미세 주입을 수행한다. 슬라이드를 이동하려면 현미경 스테이지를 사용합니다. <ol><li> 범위의 무대에 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 배아 (그림 1E)의 후방 극에 바늘의 끝을 삽입합니다. </li><li> 페달로 마이크로 인젝션 장치를 활성화하여 용액을 주입한다. 주입 액은 태아의 약간의 이동의 결과로, 내부 압력의 증가를 유도한다. </li><li> 즉시 페달을 릴리스 조심스럽게 배아에서 바늘을 제거합니다. </li><li> 주사 부위에 약간의 세포질 누설을 준수하십시오. 참고 : 인해 미세 주입 프로에 DNA / dsRNA를이 /의 siRNA와 사망의 잠재적 인 치명적 영향을 구별하는 방법자체 시저, ​​제어 실험을 수행해야합니다. 이러한 역 유전학 실험의 경우, 전용 버퍼의 주입을 포함하거나, 녹색 형광 단백질 (GFP)의 이중 가닥 RNA (dsRNA를-GFP) 또는 siRNA를를 - 유래. </li></ol></li><li> 주사는 25 ° C에서 배아를 품어 다음과 같습니다. </li></ol> 4. 후 주입 절차 <ol><li> 이틀 주입 한 후, 실체 현미경 아래에서 부화 유충 (그림 1 층)에 대한 슬라이드를 확인합니다. 유충 오일 이동하지만 빨리 유생 식품에 전사 할 필요가있다. 이 때문에, 일 슬라이드를 여러 번 확인한다. </li><li> 미세 페인트 브러시 (000)를 사용하여 부드럽게 당근 기반 애벌레 음식에 부화 유충을 전송합니다. 각 페트리 접시 당 200 애벌레의 최대까지 전송합니다. </li><li> 65 %의 습도 (25 ° C)에서 애벌레를 품어. 뚜껑은 공기 교환을 손상, 접시에 충실하지 않음을 확인합니다. </li><li> 뚜껑을 페트리 접시를 유지유충에 공기 흐름이 여전히 존재하도록 주로 마감했다. 과도한 건조를 방지 매일 요리를 확인하고, 필요한 경우, 증발을 보상 물을 추가합니다. </li><li> 그물 뚜껑에 의해 폐쇄 투명한 용기에 배양 접시를 놓고 밀기울 층을 포함하는 번데기를 선호 할 수 있습니다. 일상 insectary 양육에 관해서는, 3 차 령 애벌레 애벌레 음식 중 점프는 밀기울에 번데기가되다. </li><li> (이 세대 0, G0 임) 번데기를 수집하고 성인 양육 및 선별을위한 작은 케이지에 배치합니다. 후면 표준 애벌레 음식의 자손. </li><li> 주입 개인 키메라 일반적으로 세균이 라인 전환 실험의 경우, 차세대 변형 가능한 개인 (G1)에 대해 확인한다. 전위 이벤트는, 참으로, 세균 온라인 또는 소마를 형성 할 것이다 배아 syncytium의 핵 중 어느 발생했을 수 있습니다. <ol><li> 곧 출현 후, CO 2를 사용 G1 개인 마취 및 TRANSF 확인표면 형광 실체 현미경 아래 ormation 이벤트. 잠시 녹색 형광을위한 화면으로 EYFP 필터를 사용 (..; EMM 30분의 535 내선 20분의 500), (EMM 75분의 605.. 내선 12분의 546) 적색 형광의 유무를 선별하기 위해, DsRedwide 필터를 사용 . </li><li> 이성의 야생형 성인과 함께 작은 새장에 변형 개인을 배치하고, 초기 이형, 긴장을 기원. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

곤충 배아 핵산 마이크로 인젝션은 유전자 기능 및 생물 공학적 응용 분석 모두를 용이하게하는 범용 기술이다. 곤충 종의 증가로부터 게놈 시퀀스의 최근 간행물은 아직 미지의 기능 유전자의 기능적 특성화 도구 시급 리드. RNA 간섭 분자 기능 (49)을 추론하기위한 가장 중요한 방법 중 하나 입증 배아 미세 주입이 연구를 용이하게하고있다. 플?...

지중해 과실 파리는 (medfly) Ceratitis capitata는 국제적인 종 광범위하게 손상 과일과 재배 작물이다. 이 같은 장군 Bactrocera 및 Anastrepha에 속하는 것과 같은 여러 가지 해충 종을 포함 Tephritidae 가족에 속한다. medfly 패밀리의 대부분의 연구 종이며, 곤충 침입 (1)의 연구뿐만 아니라 해충 관리 전략을 최적화이 단지 모델이되었다. medfly 300 개 이상의 야생의 종과 재배 식물 3,4를 공격 할 수있는 multivoltine 종입니다. 손상은 성인과 애벌레 단계 모두에 의해 발생 : 성관계 여성은 미생물이 상업적 품질에 영향을 미칠 수 있도록, 산란을 위해 과일의 표면을 관통, 과일 펄프의 애벌레 피드 반면. 세 애벌레 단계 후, 애벌레는 호스트에서 등장하고 토양에 번데기가되다. Ceratitis을capitata 아프리카, 중동, 웨스턴 오스트레일리아, 중남미, 유럽, 미국 (5)의 지역을 포함하여 거의 전 세계적으로 분포를 표시합니다. 가장 일반적인 전략 medfly 침략는 살충제의 사용을 포함하는 제한 (예를 들어, 말라 티온, 스피노 사드) 및 환경 친화적 해충 멸균 기법 (SIT) 6. 후자의 접근 방식은 조사를 이온화에 노출 멸균 렌더링 남성의 수천 수백의 야생으로 방출을 포함한다. 야생 암컷 같은 멸균 남성 정합 결국 박멸 선도 모집단 크기의 감소를 초래없이 자손을 초래한다. SIT는 전 세계 여러 캠페인에서 효과가 입증되었지만, 주요 단점은 양육 및 출시 될 곤충의 수백만 살균의 높은 비용을 포함한다. 출시 개인으로 표시하면 중에 분야에서 캡처 야생 곤충에서 멸균 구별 할 필요가있다활동을 모니터링하며, 현재 형광 분말을 사용하여 달성된다. 이러한 절차는 비용이 많이 드는 바람직하지 않은 부작용 (7)이있다. 순서 최적화 및 / 또는 해충의 제어를위한보다 효과적인 방법을 개발하기 위해서는, medfly 생물학 및 유전학 널리 전세계 많은 연구자들이 탐구되어왔다. medfly 게놈 서열 8, 9의 가용성, 유전자 기능에 대한 새로운 조사를 용이하게합니다. RNA 간섭은 이러한 연구를위한 강력한 도구이며 dsRNA를 (이중 가닥 RNA) 또는 siRNA를 (작은 간섭 RNA)의 미세 주입을 통해 달성 될 수있다. 이 기술을 보여주기 위해, 예를 들어, 사용 된 그 C.에서 결정 성 고분자 연쇄 capitata 일부만 초파리 (10)의에 대해 보존된다. 프로토콜의 발전은 C. 허용 medfly 배아 microinject 할 capitata이 아닌 첫 번째가 될 수 있습니다-Drosophilid 파리 종은 유전자 변형된다. 그 계란 11 탈수 양쪽 형태와 저항의 관점에서, 초파리와 마찬가지이기 때문에, 프로토콜은 제 D. 위해 개발 된 프리 배반 배아로 플라스미드 DNA를 전달하도록 melanogaster의 12, 13 C. 초기에 사용하도록했다 capitata. 이 첫 번째 실험은 transposable 요소 미노스 (11)에 따라 medfly 세균 라인 변환을 허용했다. 이어서, 원래의 시스템은 다른 트랜스포존 기반의 접근법을 사용하여 14 변형시켰다. 이것은 나비목 트리코 NI (15)로부터 피기 백하는 경우이다. 프로토콜은 이후 상기 최적화되었으며, 이는 많은 다른 파리목 22-31의 또 다른 tephritid 종의 16-21 변환 및 허가되었다. 모든 이러한 시스템은 일반적인 바이너리 벡터 / 헬퍼 플라스미드의 형질 전환 시스템의 사용에 의존한다 : 인공 결함을 견인원하는 유전자를 포함하는 아들은 플라스미드 DNA로 조립 및 트랜스 효소 (32)를 제공하여 곤충의 게놈에 통합되어 있습니다. 형질 medfly 라인의 수는 정확성을 향상시킬 수있는 형광 정자 균주 남성 만 자손을 생산하고, 따라서 추가적인 sexing 전략을 필요로하지 않으며, 균주 사멸을 유도하는 조건을 보이면서 치사 유전자를 운반하는 균주를 포함한 여러 기능과, 생성 된 농성 모니터링 단계 33-37의. 형질 전환 된 미생물의 야생에서 박리가 모기 만 (38, 39)에 대하여 파일럿 테스트에서 발생하지만, 하나 이상의 회사는 필드 (40)으로 사용하기위한 유전자 medfly 균주들을 평가하고있다. 배아 미세 주입도 (CR을 같은 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs), 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 팔린 드롬 반복 새로운 게놈 편집 도구의 개발을 선호 할 수 있습니다ISPR) / CRISPR 관련 단백질 (9) 뉴 클레아 제 (Cas9)과 새로운 진화 및 발달 연구를 활성화뿐만 아니라 가능한 생명 공학 도구 상자를 확장합니다 원점 복귀 엔도 뉴 클레아 유전자 (HEGs). 게놈 편집 방법은 이미 모기 41 유전자 드라이브 시스템의 생성을 허용하고 medfly 그들의 전송이 임박. 여기에서 우리는 위에서 언급 한 모든 응용 프로그램에 유용 할 수 있습니다 medfly 배아에서 핵산을 마이크로 인젝션위한 범용 프로토콜을 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1 x injection Buffer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Buffer</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Construct Plasmid</td>
			<td style="width:107px;">DNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Helper Plasmid</td>
			<td style="width:107px;">DNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dsRNA</td>
			<td style="width:107px;">RNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">Phenol-Chloroform purified</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Standard Larval food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing Food&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products&#160; dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer&#8217;s yeast, 1 kg soft wheat bran</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Carrot Larval Food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing food</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adult Food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing food</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>yeast extract and sugar (1:10)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z692247</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Injection needles&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956000</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloaders</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Double slided tape</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Whatman Black circle paper</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bleach</td>
			<td style="width:107px;">Generic reagent</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">Diluite 1:2 before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paintbrush (000)</td>
			<td style="width:107px;">Generic tool</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:107px;">Instrument</td>
			<td style="width:93px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MN-153</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:107px;">Instrument</td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adult cages</td>
			<td style="width:107px;">Generic tool</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halocarbon oil 700</td>
			<td style="width:107px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8898</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ceratitis capitata</td>
			<td style="width:107px;">Animal</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">The strain used is ISPRA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of nucleic acids through embryo microinjection in the worldwide agricultural pest insect, ceratitis capitata

지중해 과실 파리 (medfly) Ceratitis capitata (WIEDEMANN) (파리목 : Tephritidae)은 매우 높은 농업 관련을 가진 해충 종입니다. 이는 생식 행동에 기인한다 : 그들은 계란과 펄프의 부화 유충 피드를 배치 할 때 여성은 과일과 야채의 외부 표면을 손상. 야생 C. capitata 인구는 전통적으로 분무 및 / 또는 환경 친화적 인 접근 방식이, 가장 성공적인은 멸균 곤충 기술 (SIT) 인 살충제를 통해 제어된다. 농성 대량 사육, 방사선 기반의 살균과 짝짓기를하는 능력을 유지하지만 비옥 한 자손을 생성 할 수없는 남성의 필드 자료에 의존한다. 출현과 함께 medfly 게놈 시퀀스의 가용성과 생명 공학 도구의 이후의 급속한 발전,이 종의 생물학에 대한 우리의 이해를 밀어 크게하고있다. 이 게놈 조작, 캘리포니아위한 새로운 전략의 확산을 선호N 인구 조절에인가 될 수있다. 이러한 맥락에서, 배아 미세 주입은 medfly 컨트롤의 도구 상자를 확장의 이중 역할을한다. 키 생물학적 과정을 조절하는 유전자의 기능을 방해 할 수있는 능력은, 참으로, medfly 침입을 기본 분자 기계에 대한 우리의 이해를 확장합니다. 또한, 배아 - 라인 변환을 달성하는 능력은 새로운 SIT 설정 미래 응용 분야에 대해 시험 할 수있는 다수의 형질 전환 균주의 제조를 용이하게한다. 실제로 유전자 조작은, 예를 들어, 현장에서 웅성 불임의 성능을 모니터링 할 수 바람직한 특성을 부여하기 위해 사용될 수 있으며, 또는 초기 생명 단계의 사멸을 초래할 수있다. 여기에서 우리는이 두 가지 목표를 달성하기 위해 medfly 배아로 핵산을 microinject하는 방법을 설명합니다.

여기에서 우리는 각각의 관심의 유전자의 기능적 특성에 관한 배아 미세 주사의 두 응용 프로그램 (사례 1)을보고하고, 형질 전환 균주의 발생 (사례 2)에서. 배아에 dsRNA를 배달 유전자 기능을 해명합니다. innexin-5 유전자를 곤충에서, 남성 및 여성 생식기 43,47,48 구?...

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

8.9K 조회수.  University of Pavia. The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

비디오: Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to particular habitats and management practices. This article shows how certain terroir signatures can be detected in the berry metabolome and transcriptome of the grapevine cultivar Corvina using multivariate statistical analysis. The method first requires an appropriate sampling plan. In this case study, a specific clone of the Corvina cultivar was selected to minimize genetic differences, and samples were collected from seven vineyards representing three different macro-zones during three different growing seasons. An untargeted LC-MS metabolomics approach is recommended due to its high sensitivity, accompanied by efficient data processing using MZmine software and a metabolite identification strategy based on fragmentation tree analysis. Comprehensive transcriptome analysis can be achieved using microarrays containing probes covering ~99% of all predicted grapevine genes, allowing the simultaneous analysis of all differentially expressed genes in the context of different terroirs. Finally, multivariate data analysis based on projection methods can be used to overcome the strong vintage-specific effect, allowing the metabolomics and transcriptomics data to be integrated and analyzed in detail to identify informative correlations.

This article describes the application of untargeted metabolomics, transcriptomics and multivariate statistical analysis to grape berry transcripts and metabolites in order to gain insight into the terroir concept, i.e., the impact of the environment on berry quality traits.

포도 베리 대사 체학 및 Transcriptomics을 통해 해석 떼루아 개념

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

연구

유전학

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

레이저를 이용한 가축 접합체의 세포질 미세 주입을

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

시퀀스 및 선택적 인식 하 여 단일 가닥 RNAs에 더블-좌초 RNAs의 화학적 펩 티 드 핵 산 수정

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell culture system. This system was developed to express foreign genes under the control of the baculoviral promoter in transient expression plasmids. Furthermore, this system can be applied to a functional assay of either the baculovirus itself or foreign proteins. The most widely and commercially available transient gene expression system is developed based on the immediate-early gene (IE) promoter of Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). However, a low expression level of foreign genes in insect cells was observed. Therefore, a transient gene expression system was constructed for improving protein expression. In this system, recombinant plasmids were constructed to contain the target sequence under the control of the Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promoter. This protocol presents the application of this heat shock-based pDHsp/V5-His (V5 epitope with 6 histidine)/Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) system; this system is available not only for gene expression but also for evaluating the anti-apoptotic activity of candidate proteins in insect cells. Furthermore, this system can be either transfected with one recombinant plasmid or co-transfected two potentially functionally antagonistic recombinant plasmids in insect cells. The protocol demonstrates the efficiency of this system and provides a practical case of this technique.

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

This protocol describes a heat shock-induced protein expression system (pDHsp/V5-His/sf9 cell system), which can be used for either expressing foreign proteins or evaluating the anti-apoptotic activity of potential foreign proteins and their truncated amino acids in insect cells.

과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Bemisia tabaci Cytogenetic 기술을 사용 하 여 계란 수정 속도 결정

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

비오틴 라벨을 사용하여 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 생체외 생화학 적 분석을 통해

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the others contain 5&#39; monophosphate generated post-transcriptionally (processed transcripts). To discriminate between the two types of transcripts, several strategies have been developed, and most of them depend on presence/absence of 5&#39; triphosphate. However, the triphosphate at primary 5&#39; termini is unstable, and it hinders a clear discrimination of the two types of transcripts. To systematically differentiate and map the primary and processed transcripts stably accumulated in maize mitochondrion, we have developed a circular RT-PCR (cRT-PCR)-based strategy by combining cRT-PCR, RNA 5&#39; polyphoshpatase treatment, quantitative RT-PCR (RT-qPCR), and Northern blot. As an improvement, this strategy includes an RNA normalization step to minimize the influence of unstable 5&#39; triphosphate.
In this protocol, the enriched mitochondrial RNA is pre-treated by RNA 5&#39; polyphosphatase, which converts 5&#39; triphsophate to monophosphate. After circularization and reverse transcription, the two cDNAs derived from 5&#39; polyphosphatase-treated and non-treated RNAs are normalized by maize 26S mature rRNA, which has a processed 5&#39; end and is insensitive to 5&#39; polyphosphatase. After normalization, the primary and processed transcripts are discriminated by comparing cRT-PCR and RT-qPCR products obtained from the treated and non-treated RNAs. The transcript termini are determined by cloning and sequencing of the cRT-PCR products, and then verified by Northern blot.
By using this strategy, most steady-state transcripts in maize mitochondrion have been determined. Due to the complicated transcript pattern of some mitochondrial genes, a few steady-state transcripts were not differentiated and/or mapped, though they were detected in a Northern blot. We are not sure whether this strategy is suitable to discriminate and map the steady-state transcripts in other plant mitochondria or in plastids.

We present a circular RT-PCR-based strategy by combining circular RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNA 5&#39; polyphosphatase-treatment, and Northern blot. This protocol includes a normalization step to minimize the influence of unstable 5&#39; triphosphate, and it is suitable for discriminating and mapping the primary and processed transcripts stably accumulated in maize mitochondrion.

원형 RT-PCR 기반 전략을 사용하여 옥수수 미토콘드리아의 기본 및 처리된 성적증명서의 차별 및 매핑

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

필라멘트 아콤유세테 헌티엘라 오만시스에서 CRISPR-Cas9 중재 게놈 편집

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...