이것은 중간엽 줄기 세포에서 작은 세포외 소포를 분리하고 농축하기 위한 간단하고 시간 효율적인 프로토콜입니다. 이 기술은 벤치탑 저울이고 작업을 위한 간단한 기기만 필요하기 때문에 대부분의 실험실에서 쉽게 채택할 수 있습니다. 작은 세포외 소포를 분리하려면 최소 1억 개의 세포를 얻기 위해 대규모로 세포를 성장시키는 것이 좋습니다.
간단하게 들리지만 이 기술의 특정 중요한 단계는 시각적 데모를 통해 더 잘 알 수 있습니다. 우리는 연구원들이 우리의 경험에서 배우고 자신있게 기술을 습득 할 수 있기를 바랍니다. 박사 과정 학생인 Mr.Chan, Hong Hao는 중간엽 줄기 세포에서 작은 세포외 소포의 분리 및 특성화에 대한 경험을 안내할 것입니다.
먼저, 컨디셔닝된 배지를 200g에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 0.22 마이크로 미터 필터를 통해 상청액을 수집하고 여과하여 220 나노 미터보다 큰 입자를 제거합니다. 원심 필터 유닛을 30 밀리리터의 0.2 마이크로미터 여과된 인산염-완충 식염수로 채웠다.
그 후 원심분리기를 3, 500g에서 섭씨 4도에서 5분간 원심분리한다. 여과액 용액 컵에 용액을 버립니다. 여과 된 컨디셔닝 된 매체 70 밀리리터를 원심 필터 장치에 넣고 섭씨 4도에서 3, 500g으로 원심 분리합니다.
여과액 용액 컵에 용액을 버립니다. 여과 된 인산염 완충 식염수 30 밀리리터를 첨가하고 섭씨 4도에서 3, 500g에서 장치를 원심 분리한다. 필터부에 농축액 채취컵을 설치하고 섭씨 4도에서 2분 동안 1, 000g에서 역원심분리하여 정제된 세포밖 소포체를 얻었다.
작은 세포외 소포체를 0.22마이크로미터 주사기 필터를 통해 걸러냅니다. 샘플을 새 튜브로 옮기고 추가 분석을 위해 섭씨 80도에 보관하십시오. 나노 입자 추적 분석을 시작하기 위해, 분리 된 인간 탯줄 유래 중간 엽 줄기 세포의 작은 세포 외 소포를 여과 된 인산염 완충 식염수에서 프레임 당 20-100 개의 입자로 희석합니다.
1 밀리리터의 일회용 주사기를 사용하여 희석 된 샘플 1 밀리리터를 anti-A 챔버에 주입합니다. 그에 따라 측정 설정을 지정하십시오. 카메라 레벨을 레벨 14로 조정합니다.
각 측정에 대해 표준 측정을 클릭하고 그에 따라 희석을 설정합니다. 그런 다음 캡처(Capture), 카메라 시작(Start Camera)을 클릭하고 카메라 레벨(Camera Level) 을 14 로 설정하여 소형 EV를 시각화합니다. 측정을 시작하려면 Create(생성)를 클릭한 다음 Run Script(스크립트 실행)를 클릭하고 파일을 저장해야 하는 위치를 선택합니다.
샘플의 필요한 세부 정보를 입력하고 확인을 클릭합니다. OK(확인) 설정을 클릭하여 스크립트를 계속하고 OK(확인)를 클릭하여 측정을 시작합니다. 측정이 기록되면 프레임당 10-100개의 적십자 표시를 포함하도록 감지 임계값 5로 결과를 분석합니다. 그리고 파란색 십자 수는 5개로 제한됩니다.
설정 확인(Setting OK)을 클릭하여 스크립트를 계속하고 해석을 시작합니다. 스크립트 완료 알림 및 내보내기에서 확인을 클릭하여 데이터를 설정된 위치로 내보냅니다. 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 소소포를 얼음처럼 차가운 방사성면역침전 분석법 용해 완충액으로 용해하고 섭씨 4도에서 30분간 배양한다.
섭씨 4도에서 5분 동안 200g에서 원심분리한 후 상층액을 채취한다. BCA 분석을 사용하여 단백질을 정량화합니다. 그에 따라 설정된 겔 전기영동을 조립하고 단백질이 스태킹 젤의 끝에 도달할 때까지 90볼트에서 겔 전기영동을 수행합니다.
전압을 200볼트로 변경하여 분해 젤이 끝날 때까지 단백질을 분리합니다. 1시간 동안 15볼트에서 젤에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 단백질을 옮기기 위해 반건식 전사를 수행합니다. PVDF 멤브레인을 트리스 완충 식염수 0.1% 트윈 20에 3% 소 혈청 알부민으로 차단하고 실온에서 1시간 동안 쉐이커에서 차단합니다.
PVDF 멤브레인을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 지속적으로 흔들면서 1차 항체와 함께 배양합니다. 다음날, PVDF 멤브레인을 TBST로 각각 5회씩 5분씩 세척하고, 상온에서 교반하면서 1시간 동안 2차 항체와 함께 더 배양한다. 다시, PVDF 멤브레인을 TBST로 5회 세척하고 화학발광 검출 시약을 사용하여 전하 결합 이미저에서 멤브레인을 시각화합니다.
ImageJ 소프트웨어를 사용하여 단백질의 발현 수준을 분석합니다. 먼저 ImageJ에서 이미지 파일을 엽니다. 밝기와 대비를 조정하여 이미지의 품질을 향상시킵니다.
얼룩이 선명하게 보일 때까지 이미지를 조정합니다. 적용 버튼을 클릭하고 이미지를 TIFF 형식으로 저장합니다. 투과 전자 현미경 기반 분석을 위해, 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포 작은 세포외 소포 샘플의 한 부분을 여과된 인산염 완충 식염수 4부로 총 부피 10마이크로리터로 희석하고, 탄소-코팅된 구리 그리드 상에서 15분 동안 인큐베이션한다.
실험실 물티슈를 사용하여 여분의 샘플을 제거하고 3분 동안 자연 건조시킵니다. 10 마이크로 리터의 1 % 포스 포 텅스텐 산 용액을 배양하여 샘플을 3 분 동안 염색합니다. 실험실 와이프를 사용하여 과량의 1 % 포스 포 텅스텐 산 용액을 제거하고 3 분 동안 자연 건조시켜 투과 전자 현미경으로 이미지를 만듭니다.
인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 작은 세포외 소포체는 53 나노미터의 입자 크기 모드를 갖는 반면, 입자 크기의 다른 중요한 피크는 96 및 115 나노미터였다. NTA에 의해 측정된 인간 탯줄 유래 MSC 소세포밖 소포체의 농도는 밀리리터 당 10 내지 10번째 입자의 7.75배였다. BCA 분석으로 측정한 인간 탯줄 유래 MSC 작은 세포외 소포의 단백질 농도는 밀리리터당 약 80마이크로그램이었습니다.
웨스턴 블랏팅 분석에서, 인간 탯줄 유래 MSC 작은 세포외 소포체는 엑소좀 마커 CD9, CD81 및 TSG101에 대해 양성 밴드를 나타내었지만 GRP94에 대해서는 음성이었습니다. 분리된 인간 탯줄 유래 MSC 작은 세포외 소포체를 TEM 하에서 시각화하여 크기와 형태를 결정했습니다. 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포는 크기가 약 100 나노미터인 작은 세포밖 소포체로서 컵 모양의 이중층 막 구조를 나타내었다.
프로토콜의 성공적인 개발로 우리는 이제 재생 의학에서 중간엽 줄기 세포 유래 작은 세포외 소포의 치료 가능성을 밝힐 수 있습니다.
