우리는 화학과 생명 과학 부서를 오가며 다양한 항암 약물 표적을 위한 새로운 보조 반응성 공유 리간드를 개발하고 있습니다. 이 분자가 미래에 치료제나 화학 프로브로 사용될 수 있기를 바랍니다. 따라서 공유 리간드를 선별하기 위한 몇 가지 기술이 존재합니다.
이는 크게 배양된 세포와 함께 화합물을 배양하는 단백질체학 기술과 분자가 라벨링하는 단백질을 결정하는 데 사용되는 질량 분석법과 친전자성 라이브러리가 개별 단백질과 함께 배양되는 표적 기반 방법으로 나눌 수 있습니다. 중요한 실험적 과제는 공유 리간드의 반응성과 관련이 있습니다. 과도하게 반응하는 분자는 스크리닝 분석 중에 히트로 나타나는 경우가 많지만 세포의 많은 다른 단백질을 비선택적으로 라벨링하기 때문에 적합하지 않습니다.
따라서 활성의 복합은 공유 약물 발견의 모든 단계에서 고려하는 것이 중요합니다. 그래서 Imperial의 Mann과 Armstrong 그룹은 정량적 비가역적 테더링(Quantitative Irreversible Tethering) 또는 qIT 분석이라고 하는 단백질 표적에 대해 친전자성을 스크리닝하는 새로운 방법을 개발했습니다. 당사의 프로토콜은 단백질 표적에 대해 친전자성을 스크리닝하는 매우 필요한 새로운 방법을 제공하며, 이는 확장 가능하고 질량 분석이 필요하지 않으며 복합 고유 반응성을 제어합니다.
시작하려면 필요한 모든 원액을 준비하고 실험 전에 2시간 동안 실온에 두십시오. 약 30분 동안 아르곤 가스로 정량적 탈기, 비가역적 테더링 또는 qIT 분석 버퍼를 제거합니다. 완충액 교환을 수행하려면 탈기된 qIT 분석 완충액을 초과하는 단백질 용액을 스핀 필터 장치에 희석하고 섭씨 4도에서 15분 동안 4, 000G에서 회전하여 단백질을 농축합니다.
그런 다음 탈기된 qIT 분석 완충액에서 표적 단백질 용액을 15마이크로 어금니 농도로 희석하여 9ml의 용액을 준비합니다. TCEP-아그라오스 용액, qIT 완충액 및 글루타티온 스톡을 384웰 플레이트의 적절한 웰에 분주합니다. fragment library plate의 각 해당 well에서 1.8μl를 전달하여 qIT 분석 버퍼에서 각 화합물을 1.5mmol로 희석하고 3%DMSO를 더한 복합 희석 플레이트를 생성합니다.
384 피펫팅 스테이션을 사용하여 화합물 희석 플레이트의 각 웰에서 20마이크로리터의 복합 용액을 두 반응 플레이트로 옮깁니다. 먼저 원하는 단백질과 글루타티온을 사용하여 정량적 비가역적 테더링 또는 qIT 분석을 설정합니다. 500마이크로몰 CPM 스톡을 마이크로 원심분리기 튜브의 111.2마이크로리터 분취액에 분배하고 섭씨 20도에서 보관합니다.
CPM 스톡을 해동한 후 40ml의 qIT 분석 담금질 완충액에 추가하여 1.4마이크로몰 용액을 준비합니다. 27마이크로리터의 CPM 담금질 용액을 2개의 새로운 384웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 단백질 반응 플레이트를 200G에서 3분 동안 원심분리하여 TCEP-아가로스를 펠렛으로 만듭니다. 미리 결정된 시점에서, 384 피펫팅 스테이션을 사용하여 단백질 반응 플레이트의 모든 웰에서 CPM 담금질 플레이트로 3마이크로리터의 샘플을 옮깁니다.
바닥에서 TCEP-아가로스를 흡입하지 않도록 웰 상단에서 샘플을 제거합니다. CPM 담금질 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하고 384나노미터에서 여기(excitation)와 470나노미터에서 방출로 형광 강도를 측정합니다. 먼저 원하는 단백질로 정량적 비가역적 테더링(tethering) 또는 qIT 분석을 수행하고 CPM 플레이트에서 샘플을 퀀닝합니다.
각 담금질에 대해 Z 프라임을 분석 품질의 측도로 계산합니다. 그런 다음 열 1과 2의 negative control well과 column 23 및 24의 positive control well에 대한 평균 형광 값을 계산합니다. 각 반응을 양성 대조군과 음성 대조군의 평균 형광 값으로 잘 정규화하고, 글루타치온 및 표적 단백질과 반응하는 각 화합물에 대한 시간 대비 변형 백분율을 별도로 플롯합니다.
GraphPad를 사용하여 방정식을 사용하여 두 반응에 대한 정규화된 수정 백분율 대 시간 데이터를 1상 지수 감쇠 모델에 맞추고, AE를 KT C의 거듭제곱에 맞춥니다.각 단편에 대한 속도 향상 계수 또는 REF 값을 계산하기 위해 단편이 단백질 및 글루타티온과 반응하는 속도를 사용합니다. 마지막으로, 히트 프래그먼트를 선택하려면 REF 임계값, 임의의 히트율을 설정하거나 REF가 기하 평균보다 3 표준 편차가 큰 프래그먼트를 선택합니다. 화합물 1은 글루타티온보다 6배 더 빠른 속도로 표적 단백질의 시스테인 잔류물과 반응하여 3보다 큰 REF의 Hit 기준을 충족했습니다.
화합물 2는 글루타티온에 비해 타겟 시스테인 잔기와의 가속화된 반응 속도를 보여주지 않았으며, 이는 생산적인 비공유 상호작용의 부족을 나타내므로 유효 물질로 선택되지 않았습니다.
