Trabalhamos entre os departamentos de química e ciências da vida, desenvolvendo novos ligantes covalentes reativos assistentes para uma variedade de alvos de drogas anticâncer. Espera-se que essas moléculas sejam usadas no futuro, seja como terapêutica ou possivelmente como sondas químicas. Portanto, existem várias tecnologias para triagem de ligantes covalentes.
Estes podem ser amplamente divididos em técnicas proteômicas em que os compostos são incubados com células cultivadas e espectrometria de massa usada para determinar quais proteínas as moléculas rotulam e métodos baseados em alvos onde bibliotecas de eletrófilos são incubadas com proteínas individuais. Um desafio experimental significativo está relacionado à reatividade de ligantes covalentes. Moléculas excessivamente reativas geralmente aparecem como hits durante os ensaios de triagem, mas são inadequadas, pois rotulam de forma não seletiva muitas proteínas diferentes na célula.
O composto de atividade é, portanto, crucial a ser considerado em todas as etapas da descoberta de medicamentos covalentes. Assim, os grupos de Mann e Armstrong no Imperial desenvolveram um novo método de triagem de eletrófilos contra um alvo de proteína chamado amarração irreversível quantitativa ou ensaio qIT. Nosso protocolo fornece um novo método muito necessário de triagem de eletrófilos contra um alvo de proteína, que é escalável, não requer espectrometria de massa e controla a reatividade intrínseca do composto.
Para começar, prepare todas as soluções de estoque necessárias e deixe-as em temperatura ambiente por duas horas antes do experimento. Desgaseifique o tethering quantitativo, irreversível ou o tampão de ensaio qIT com gás argônio por aproximadamente 30 minutos. Para uma troca de tampão eficaz, diluir a solução proteica em excesso do tampão qIT desgaseificado em uma unidade de filtro de centrifugação e girar a 4.000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius para concentrar a proteína.
Em seguida, diluir a solução de proteína-alvo até uma concentração de 15 micromolares em tampão de ensaio qIT desgaseificado para preparar nove mililitros da solução. Dispense a solução TCEP-agraose, o tampão qIT e o estoque de glutationa nos poços apropriados das placas de 384 poços. Transfira 1,8 microlitros de cada poço correspondente da placa da biblioteca de fragmentos para criar uma placa de diluição composta diluindo cada composto a 1,5 milimolar em tampão de ensaio qIT, mais 3% de DMSO.
Use uma estação de pipetagem 384 para transferir 20 microlitros de solução composta de cada poço da placa de diluição do composto para ambas as placas de reação. Para começar, configure o tethering irreversível quantitativo ou ensaio qIT com a proteína e a glutationa desejadas. Dispense o estoque de 500 micromolares CPM em alíquotas de 111,2 microlitros em tubos de microcentrífuga e armazene-os a 20 graus Celsius.
Depois de descongelar o estoque de CPM, adicione-o a 40 mililitros de tampão de têmpera de ensaio qIT para preparar uma solução de 1,4 micromolar Dispense 27 microlitros de solução de têmpera de CPM em cada poço de duas placas frescas de 384 poços. Centrifugue a placa de reação de proteínas a 200 G por três minutos para granular TCEP-agarose. Em pontos de tempo predeterminados, use uma estação de pipetagem 384 para transferir três microlitros de amostra de cada poço da placa de reação de proteína para a placa de resfriamento CPM.
Remova a amostra do topo do poço, evitando aspirar TCEP-agarose na parte inferior. Incubar as placas de têmpera CPM à temperatura ambiente durante uma hora e medir a intensidade da fluorescência com uma excitação a 384 nanómetros e emissão a 470 nanómetros. Para começar, execute o tethering quantitativo-irreversível ou o ensaio qIT com a proteína desejada e tempere as amostras na placa CPM.
Para cada têmpera, calcule Z prime como uma medida da qualidade do ensaio. Em seguida, calcule os valores médios de fluorescência para os alvéolos de controlo negativo nas colunas um e dois e para os alvéolos de controlo positivo nas colunas 23 e 24. Normalize bem cada reação para os valores médios de fluorescência dos controles positivo e negativo e represente separadamente a porcentagem modificada versus o tempo para cada composto que reage com a glutationa e com a proteína alvo.
Usando o GraphPad, ajuste os dados de porcentagem normalizada modificada versus tempo a um modelo de decaimento exponencial de uma fase para ambas as reações usando a equação, AE à potência de KT C. Use a taxa na qual os fragmentos reagem com proteína e glutationa para calcular o fator de aumento da taxa ou valor REF para cada fragmento. Por fim, para selecionar fragmentos de ocorrência, defina um limite de REF, uma taxa de ocorrência arbitrária ou selecione fragmentos com REF três desvios padrão maiores que a média geométrica. O composto um reagiu com o resíduo de cisteína na proteína alvo a uma taxa seis vezes maior do que com a glutationa, atendendo ao critério Hit de REF maior que três.
O composto dois não mostrou uma taxa de reação acelerada com o resíduo de cisteína alvo em comparação com a glutationa, indicando uma falta de interações produtivas não covalentes e, portanto, não foi selecionado como um hit.
