본 연구의 범위는 주로 항종양 활성이 개선되고 생체 내 지속성을 가진 인간 iPSC, CAR, NK 세포를 개발하여 다양한 악성 종양을 더 잘 치료할 수 있도록 하는 데 중점을 두고 있습니다. 이 새로운 CAR iPSC NK 생성 프로토콜을 통해 당사는 이러한 세포가 종양 미세환경 저항성을 극복하고 효능을 개선하며 안전하고 확장 가능한 생산을 보장할 수 있는 방법에 대한 답을 찾는 것을 목표로 합니다. iPSC 유래 CAR NK 세포 개발의 주요 실험 과제는 iPSC를 기능성 케이스로 일관되고 효율적으로 분화하고, 부작용 없이 안정적인 CAR 발현을 보장하고, 생체 내 지속성을 개선하는 것입니다.
또한 연구자들은 임상 적용에 대한 확장성, 면역 거부 반응 및 규제 보유자에 대한 문제에 직면해 있습니다. 당사는 트랜스포손 기반 유전자 변형을 사용하여 효율적인 비바이러스 기반 CAR 유전자 통합을 확립함으로써 iPSC 유래 CAR NK 세포 연구를 크게 발전시켰습니다. 또한 면역 관문을 삭제하기 위해 iPSC 수준에서 CRISPR-Cas9을 최적화하고, 고형 종양 모델에서 세포 및 종양 효능 및 생체 내 지속성을 개선하기 위해 TMA 인자를 최적화했습니다.
non-viral piggyback vector mediated CAR gene expression을 사용하는 프로토콜로, iPSC CAR NK 세포에 대한 안전하고 효율적이며 확장 가능한 유전자 변형 개발의 격차를 해소하는 것을 목표로 하고 있으며, 이 방법은 삽입 돌연변이 유발의 위험을 줄이고 암 면역 요법을 위한 CAR NK 세포 생성의 재현성과 비용 효율성을 향상시킵니다. 앞으로 본 연구실은 면역 관문을 표적으로 하는 새로운 공학적 iPSC 유래 NK 세포 개발에 중점을 둘 것입니다. 또한 생체 내 지속성 및 항종양 활성을 향상시키기 위해 이중특이성 또는 삼중특이성 항체를 사용하여 다양한 종양 미시 환경 요인을 표적으로 하는 방법을 조사할 것입니다.
스핀 배아체 또는 EB 형성 통로를 시작하기 위해, MT 잉여를 포함하는 6개의 웰 기저막 매트릭스 사전 코딩된 플레이트에서 웰당 약 200,000개의 엔지니어링된 CAR iPSC를 생성하고, 2일 후 섭씨 37도에서 5%이산화탄소로 세포를 배양하고, 배양 배지를 제거하고 섭씨 37도에서 5분 동안 1ml의 예열 TrypLE Select로 배양하여 세포를 분리합니다. 그런 다음 세포 응집체를 단일 세포 현탁액으로 조심스럽게 해리하고 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 해리 반응을 멈추기 위해 3밀리리터의 PBS를 첨가하십시오.
다음으로, MK SR-plus 배지에서 셀을 다시 현탁시키고 70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 여과하여 응집체를 제거합니다. 세포를 원심분리하십시오. 펠릿을 5 밀리리터의 PBS로 세척 한 다음 1 밀리리터의 EB 형성 배지에 다시 현탁시킵니다.
계수 후, 사이토카인과 10 마이크로몰 ROCK 억제제를 함유한 EB 형성 배지를 사용하여 세포를 적절한 밀도로 희석합니다. 다채널 피펫 씨 3000에서 10 의 96 웰 플레이트에 있는 EB 매체의 100 마이크로리터에 있는 웰 당 000 세포를 사용하여. 300G에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 5%의 이산화탄소를 함유한 섭씨 37도에서 6일 동안 배양합니다.
배아체의 질을 확인하기 위해 먼저 EB를 해리하기 위해 0.4% 치킨 혈청과 함께 예열된 0.25% 트립신 4ml를 준비합니다. 6일 후 10-30EB를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. EB에 트립신 치킨 세럼 용액을 첨가하고 수조에서 배양합니다.
분리 중 EB를 10분 동안 3분에서 5분마다 볼텍싱합니다. 트립신화된 EB를 피펫팅하여 위아래로 여러 번 혼합하여 철저한 해리를 보장합니다. 그런 다음 PBS 5ml를 첨가하여 트립신화 과정을 중지합니다.
70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 세포 용액을 새 원뿔형 튜브로 여과합니다. 그런 다음 300G에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 펠릿을 3-5밀리리터의 새로운 EB 배지에 다시 현탁시킵니다. 계수 후 일반적인 EB 마커로 세포를 염색합니다.
100마이크로리터의 유동 완충액에 해리된 EB 단일 세포를 포함하는 각 튜브에 권장 부피의 항체를 추가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 플로우 버퍼로 세포를 두 번 세척합니다. SYTOX blue live dead stain을 첨가하고 유세포 분석을 사용하여 분석합니다.
6웰 플레이트의 각 웰에 5-10마이크로리터의 2% 멸균 젤라틴 용액을 코딩하는 것으로 시작합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 2-4시간 동안 배양합니다. 배양 후, 남아 있는 젤라틴 용액을 흡인하고 사이토카인을 함유한 자연 살해 또는 NK 분화 배지 3ml를 젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰에 첨가합니다.
그런 다음 1ml 피펫을 사용하여 엔지니어링된 CAR iPSC에서 파생된 스핀 EB를 10cm 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 사이토카인을 함유한 NK 분화 배지 3ml를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 1밀리리터 마이크로 피펫을 사용하여 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 16-20EB를 분배하고 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 3-4주 동안 배양합니다.
배양 후 현탁 세포에서 유세포 분석을 통해 NK cell marker CD45 positive 및 CD56 positive의 발현을 평가합니다. 현탁 세포의 80% 이상이 CD45 양성 및 CD56 양성을 발현할 때. 70마이크로미터 필터에 세포를 통과시켜 덩어리를 제거하여 세포를 수확합니다.
NK 세포 내의 인공 항원 제시 세포 또는 인공 APC를 공동 배양하기 전에 세포는 인공 APC에 100개의 회색을 조사하고 동결 줄기로 보존합니다. NK 세포를 채취한 후 인터루킨-2와 인터루킨-15를 1밀리리터당 50단위가 보충된 NK 팽창 배지에서 밀리리터당 5개의 세포 5배의 5배의 밀도로 배양합니다. 방사선 조사된 해동 인공 APC를 NK 세포에 1:1 비율로 첨가하고 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 배양합니다.
시작하려면 유세포 분석기를 켭니다. 항 GPC3 CAR iPSC 유래 NK 세포에 대한 NK 활성화 수용체의 발현을 평가하여 CAR 케이스 세포의 활성과 성숙 상태를 확인합니다. Caspase-3/7 분석용.
GPC3 CAR iPSC 유래 NK 세포의 표적 세포를 계수하고 섭씨 37도에서 15분 동안 빛 보호 하에서 PBS의 최종 농도 5마이크로몰로 CellTrace Violet 염료로 사전 염색합니다. CAR iPSC 유래 NK 세포와 공동 배양 전에 섭씨 37도에서 다양한 효과기 대 표적 비율로 염색 대상 세포를 완전한 배양 배지에서 세척합니다. 3시간 30분의 공동 배양 후.
Caspase-3/7 green 검출 시약을 추가하고 30분 더 배양합니다. 염색의 마지막 5분 동안 SYTOX 사세포 염색 용액을 첨가하고 부드럽게 섞습니다. 유세포 분석을 사용하여 염색된 세포를 분석합니다.
GPC3 CAR 엔지니어링 IPC로부터 스핀 EB의 형성은 6일째에 관찰되었습니다. 조기 분화 확인. GPC3 CAR IPC로부터 분화된 자연살해(natural killer) 또는 NK 세포는 3일차부터 28일차까지 다양한 단계에서 뚜렷한 형태학을 보여주었다.
유세포 분석은 조혈 항원 CD34 및 CD31의 발현과 소량의 CD43의 발현을 보여주지만 6일째에 야생형 및 GPC3 CAR iPSC에서 파생된 스핀 EB 모두에서 CD45가 아직 발현되지 않았습니다. 사례별 마커는 35일째에 GPC3 CAR iPSC 유래 NK 세포의 성숙한 야생형에서 검출되었습니다. NK cell로의 성공적인 분화를 확인합니다.
expanded wild type과 anti GPC3 CAR iPSC 유래 NK 세포는 다양한 활성화 마커를 나타내며 NK 세포 성숙을 입증했습니다. 유세포분석을 사용하여 종양 세포주에서 GPC3 항원 발현을 확인하여 anti GPC3 CAR iPSC 유래 NK 세포에 대한 표적 특이성을 검증했습니다. 항 GPC3 CAR iPSC 유래 NK 세포는 야생형 iPSC NK 세포에 비해 HepG2, SNU-449, CAL 27 및 SKOV3 세포주를 발현하는 GPC3에 대해 더 높은 세포독성 활성을 보였습니다.
