우리의 실험실 프로토콜은 CAR T 세포 치료와 인간 게놈 편집의 조합을 가능하게 합니다. 실험실 절차는 높은 효율을 가진 최대 3개의 유전자를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9를 가진 접근입니다. 그리고 마지막으로, 우리의 접근 방식은 인간 적인 임상 시험으로 번역될 수 있습니다.
설명된 방법은 다른 CAR 구조 및 표적 유전자에 적용될 수 있다. 기술의 기초는 더 큰 규모로 번역 될 정도로 강력하고 추가 개발을위한 학술 및 산업 협력자. 이 프로토콜을 처음으로 시도할 때, 정확한 잠복기를 가능하게 하기 위하여 가이드 RNA 스크린에 있는 단의 수를 제한합니다.
설명된 바와 같이 문화 조건과 파종 밀도를 준수하는 것은 우리의 경험에 매우 중요한 것으로 입증되었습니다. 우선, 건강한 자원 봉사 기증자로부터 자가 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC를 얻고 시판적으로 이용 가능한 CD4 및 CD8 선택 키트를 사용하여 CD4 및 CD8 양성 T 세포를 분리하십시오. CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포를 1대 1 비율로 결합하고 R10의 밀리리터당 3백만 개의 세포를 배양하고, 각 인간 IL7 및 인간 IL15의 밀리리터 당 5 나노그램으로 보충하여 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 보충합니다.
다음 날, T 세포와 원심분리기를 5~1,000만 개의 세포에 5분 동안 300배 G로 계산합니다. 모든 상류제를 버리고 셀 펠릿을 최소한의 필수 매체로 씻어 내십시오. 제조업체의 지시에 따라 100 마이크로리터의 핵 애정 솔루션에서 펠릿을 다시 중단합니다.
세포를 세척하는 동안, 실온에서 10 분 동안 5 마이크로 그램의 단일 가이드 RNA와 Cas9 뉴클레아제 10 마이크로 그램을 배양하여 리보뉴클레오단백질 또는 RNP 복합체를 준비합니다. 단일 가이드 RNA 없이 모의 제어를 포함한다. 다시 중단된 세포를 RNP 복합체와 결합하고 4개의 마이크로몰러 전기화 증강기의 4.2 마이크로리터를 추가합니다.
잘 섞어서 전기기공 큐벳으로 옮춥니까. 펄스 코드 EH111을 사용하여 세포를 전기화한 다음 R10에서 밀리리터 당 5백만 개의 세포를 배양한 다음 밀리리터 인간 IL7 당 5 나노그램과 12 개의 우물 판에서 48 시간 동안 섭씨 30도의 인간 IL15로 보충합니다. 인큐베이션 후 T 세포 활성화 및 확장을 진행합니다.
표준 프라이머 설계 소프트웨어에 PCR 앰플리코의 시퀀스를 입력하여 시퀀싱 프라이머를 설계합니다. 설계 소프트웨어는 Sanger 시퀀싱에 적합한 여러 프라이머 시퀀스를 제안합니다. gRNA 절단 부위의 상류 또는 하류에 적어도 150개의 베이스 쌍을 결합하는 전방 및 역프라이머를 선택하여 인델 주위의 좋은 시퀀싱 품질을 보장합니다.
TIDE 분석을 사용하여 유전체 수준에서 녹아웃 효율을 감지합니다. 알고리즘은 시퀀스 추적에서 인델스펙트럼을 정확하게 재구성하고 R 정사각형 값을 계산합니다. 활성화 후, T 세포는 문화권으로 확장되고 향후 연구를 위해 냉동 보존됩니다.
확장 하는 동안, 인구 두 배로 및 볼륨 변경 모의 및 편집 된 CAR T 셀에 대 한 프로토콜에 걸쳐 추적 됩니다. 확장 기간 동안 증식 및 활성화에서 큰 변화가 감지되지 않았습니다. 세포가 극저온 보존되면, CAR 발현의 수준은 모의 편집 및 녹아웃 CAR T 세포 모두에 대한 추가 기능 적 연구를 위해 결정되었다.
중요한 변화는 관찰되지 않았습니다. 녹아웃 효율성은 여러 기술을 사용하여 결정할 수 있습니다. 이러한 대표적인 유동 세포측정플롯에서, PDCD1 및 TRAC loci는 단일 가이드 RNA를 사용하여 표적으로 삼았으며, PDCD1 단일 가이드 RNA에 대한 90%의 효율과 여러 명의 건강한 기증자에 걸쳐 TRAC 단일 가이드 RNA에 대해 98%의 효율을 나타냈다.
Cas9 및 가이드 RNA의 어금니 비율이 정확한지 확인하는 것이 중요합니다. 시술 중에 세포는 항상 섭씨 4도에서 유지되어야하며 장기간 전기 기화 용액에 남아 있지 않아야합니다. CAR 보존 후, CRISPR 엔지니어링 CAR T 세포는 세포 독성 분석, 사이토카인 생성 및 신유전학 또는 제노그래프 종양 마우스 모델과 같은 생체 내 기능적 분석에 사용될 수 있다.
CRISPR Cas9 기술을 사용하는 우리의 접근 방식은 이제 임상 시험에 적용되고 있습니다. 접근은 암, 뿐만 아니라 전 세계 아이들과 성인의 수백만에 영향을 미치는 헤모글로빈노피와 같은 비 악성 유전 무질서를 위해 둘 다 이용될 수 있습니다.
