저자는 자신의 지원과 피드백을 올리비에 Manches, 박사, Davor Frleta 박사와 메건 오브라이언, MD를 인정하고 싶습니다. 이 연구는 알레르기 및 전염병 국립 연구소에 의해 지원 및 NIH는 건강 관련 연구 (AI089030)와 RO1 (AI081848의 다양성을 촉진하기 위해 개별 Predoctoral 동호회 (F31)에 루스 L. 키르 국립 연구 봉사상을 부여 자금으로 완료되었습니다 ).

윤리 정책 : 연구 샘플을 얻어 기증자의 동의와 연구에 저장됩니다. 모든 샘플 코드 또는 사용하기 전에 익명으로 처리해야한다. 이 프로토콜은 우리의 임상 시험 심사위원회의 가이드 라인을 따른다. 1. 단핵구 유래 수지상 세포에 인간의 말초 혈액 단핵구의 분화. 참고 : 인간 버피 코트는 인간의 말초 혈액 세포 (PBMC를)의 소스 역할을하고 뉴욕 혈액 센터 (뉴욕, NY)에서 얻을 수 있었다. 혈액 기증자는 건강한 지원자입니다. 오일 절차는 조직 배양에 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 도금을 시작은 35,36을 플라스. 게시 된 프로토콜에서 주목할만한 차이점은 다음과 같습니다 : <ol><li> 10cm 폴리스티렌 조직 배양 플레이트보기 플라스크 당 2 × 13의 PBMC를 다운로드 고착 대신하는 필터 캡 225cm이 비 발열 폴리스티렌 조직 배양 플라스크를 사용S (58cm 2) (1 단계). </li><li> 5 % 풀링 된 인간 혈청 (PHS, 30 ㎖)으로 미디어를 준비 500 ML RPMI-1640 + L-글루타민, 5 ㎖ 1 M HEPES 버퍼, 1.4 ㎖의 50 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 (5 % PHS 미디어) 여과 한 다음를 통해 20 μm의 필터. 50 ㎖ 5 % PHS 미디어 225cm 당 조직 배양 플라스크의 총을 추가합니다. </li><li> 25 ML 신선한 RPMI-1640 접착 세포를 세 번 씻으십시오. 각 세척시 5 초 동안 격렬하게 흔들어 및 비 부착 세포 (4 단계)를 대기음. </li><li> 하루 한 PBMC는 처음 단계에서 도금 될 때 100 IU / μL 0 일, 2 플라스크 (3 단계) 당 GM-CSF, 4. 0 일 400 IU / μL IL-4, 380 μL의 190 μl를 추가 정의된다 1 (단계 8). </li><li> 1 × 10 6 세포 / ml (15 단계)의 농도가 수확 일 5 moDCs. </li><li> 자신의 휴식 상태로 즉시 moDCs를 사용합니다. 17 ~ 22 단계가 수행되지 않습니다. 참고 : 샘플이 최상의 결과를 최대한 빨리 수집 후 처리해야합니다. </li><li> 농도에서 나누어지는 moDCs2 × 5 세포의 기 /도 96 웰 둥근 바닥 플레이트 (웨스턴 블롯, ELISA, FACS) 또는 폴리-L-라이신 처리 chamberslide (현미경) 상 실험을위한의 (1 × 10 6 세포 / ml의 200 μL / 웰) . 참고 : 완전히 비자극 (음성 대조군) 활성화 뒤에 만 만 활성화 및 프라이밍 프라이밍, 적어도 4 조건이 있습니다. 조건이 필요한 경우 희석제 R848에 대한 컨트롤과 nigericin을 포함하도록 확장 할 수 있습니다. 다운 스트림 분석이 ICS 인 경우, 중복 이소 컨트롤에 대한 필요합니다. </li></ol> . 2 inflammasome을 준비하기 - 신호 1 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 DMSO에 동결 건조 R848을 재구성. RPMI-1640 RT에서 근무 주식을 희석. </li><li> 18 시간 동안 우물을 충당하기 위해 10 μM 최종 농도 R84​​8를 추가합니다. 장소 37 ° C에서 인큐베이터에있는 세포와 5 % CO 2. </li></ol> 3 NLRP3 inflammasome을 활성화 -. 신호2 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 에탄올에 동결 건조 nigericin을 재구성. 해당 조건에 추가하기 전에 RPMI-1640 RT에서 근무 주식을 희석. </li><li> 20 μm의 최종 농도 nigericin 추가하고 37 ° C에서 인큐베이터에 반환하고 5 % CO 2 ~ 6 시간 동안. 더 세척 단계는 프라이밍 사이에 활성화 중에 발생하지 않습니다. 주 : IL-1β의 분비 A, 모 넨신, 디 니트로 페놀 또는 카르 보닐 시안화 chlorophenylhydrazone 37, 38 brefeldin 칼슘 ionophores의 존재에 의해 증가된다. 이 IL-1β의 분비를 변경 때문에 inflammasome을 프라이밍 또는 활동을 분석 할 때 그러므로, 이러한 분비 억제제의 첨가는 권장하지 않습니다. </li></ol> 4. IL-1SS 샘플 컬렉션 <ol><li> 3 분 974 XG에 세포 상층 액 접시를 원심 분리기. </li><li> 세포 펠렛을 방해하지 않고, 뜨는을 대기음 등으로 전송eparate 라운드 상층 액에서 사이토 카인의 분비를 측정하기 위해 판을 바닥. 참고 : 상층 액이 일시적으로 -20 ° C에 저장하거나 할 수 있습니다 -80 장기 기억 ° C. </li><li> 세포 샘플에서 모든 세포 IL-1β를 제거하기 위해 3 분 974 XG에 1X PBS 200 μL와 세포 펠렛을 세 번 씻으십시오. 참고 : 96 웰 플레이트에서 세포 펠렛을 세척 할 때 샘플을 방해하지 않도록, 수거함에 신속 판 반전하여 세척을 제거합니다. </li></ol> 5. 세포 및 뜨는 샘플에서 IL-1SS 측정 <ol><li> 세포 내 사이토 카인 염색법 (ICS)는 : ICS 프로토콜은 39, 40에 대하여 설명한다. 참고 : 다운 스트림 분석은 현미경 경우 세포를 중단하지 않습니다. 모든 세척 및 포부 (다운 스트림 분석에 따라) 세포 층 / 펠렛을 방해하지 않고 수행해야합니다. <ol><li> 적절한 우물에 5 % PHS 매체 100 μl를 추가합니다. 추가적절한 볼륨 (약 1 μl/2x10 5 셀 또는 1 μL / 웰)의 찬란 α-의 CD11c 및 α-CD14 표지 (표현형 마커, 클론 B-ly6 및 MφP9, 각각) 또는 이소 제어에서 10 분 동안 세포에 어둠 속에서 RT. </li><li> 3 분 974 XG에 1X PBS로 3 회 세척한다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 4 % PFA 100 μl를 추가하여 세포를 고정합니다. </li><li> 포인트를 일시 정지 : 1X PBS에 4 ° CO / N에서 3 분 및 저장을위한 974 XG에 100 μL 1X PBS로 세척. </li><li> 30 분 동안 세포 permeabilization 버퍼 100 μl를 추가합니다. 참고 : permeabilization 버퍼는 0.3 % 트리톤 X-100로 1X PBS로 구성하고, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) permeabilization이다. 다운 스트림 분석은 현미경 때 자기편 세포를 방해하지 않습니다. </li><li> 적절한 α-IL-1β-FITC의 양 (약 62 NG의 antibody/2x10 5 셀, 약 또는 2.5 μL / 잘) (클론 8516) 나에 대한 아이소 타입 컨트롤을 추가37 ° C에서 인큐베이터에서 2 시간 </li><li> 어둠 속에서 3 분 동안 974 XG에서 permeabilization 버퍼 200 μL와 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 선택 사항 : DAPI와 얼룩은의 mountant를 추가하고, 유리 슬라이드 위에 부드럽게 커버 슬립을 배치합니다. 현미경 이미지를 캡처하기 전에 O / N을 치료의 mountant을 허용합니다. </li><li> FACS 또는 현미경으로 데이터를 획득. 참고 : FACS이나 현미경으로 분석 적절한 염색 각 조건에 대한 아이소 타입을 비교한다. <ol><li> FACS : 한 번에 하나의 샘플을 취득. MODC 인구 프로 IL-1β 염색을 분석하기 전에 세포 -의 CD11c + CD14에 게이팅 다음에 살아있는 세포에 FSC / SSC 게이트를 설정합니다. </li><li> 현미경 : 긍정적 인 염색 샘플을 사용하여 노출 시간을 설정 - R848 치료. 프로 IL-1β 표현 moDCs을 +의 비율을 결정하는 - DAPI + 프로 IL-1β의 +와 DAPI + 프로 IL-1β를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li><li> SDS-페이지 : 면역 블롯이 프로 IL-1β를 감지하기 위해 수행된다. 참고 : 아래에서 설명하는 기술은 표준 면역 블롯 기술, 그라데이션 4-20% 폴리 아크릴 아마이드 젤, 형광 또는 화학 발광 검출 (41, 42)을 결합한다. <ol><li> 직접 용해 완충액 (5 ㎕의 세포 용해 완충액으로 1:1로 희석 하였다 β-mercaptoethanol/950 μL 램리 시료 완충액)을 변성 10 μL를 Lyse있는 세포. 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 해물을 전송합니다. </li><li> 100 ℃에서 10 분 동안 건조 접시에 열 해물 </li><li> 액체 볼륨을 집중하는 1 분 minicentrifuge에 20,800 XG에서 해물 스핀. 지점을 일시 정지 : 샘플은 단기 저장을 위해 -20 ° C에서 얼 수있다. </li><li> 폴리 아크릴 아마이드 젤에 전체 볼륨을로드합니다. 염료 전면 겔의 바닥을 실행까지 약 1 시간, 또는위한 젤 상자를 통해 140 V를 실행합니다. </li><li> PVDF Immobilon-FL의 membr에 폴리 아크릴 아마이드 겔에서 단백질을 전송100 V. 블록 트리스 버퍼 식염수에 5 % BSA와 멤브레인 / 0.1 % 트윈 20 (TBS-T) 1 시간 동안 90 분 동안 고대 근동. 참고 : PVDF Immobilon-FL은 형광 검출에 사용하기에 가장 적합합니다. 다른 검출 기술이 배경 잡음비를 증가시키기 위해 서로 다른 조성을 갖는 막을 추천. </li><li> 5 % BSA / TBS-T의 10 ㎖에 기본 및 보조 항체를 희석. 흔들어 섞으면 서 1 시간 동안 실온에서 이차 항체를 흔들어 동안 4 ° CO / N에서 기본 항체 배양을 수행합니다. </li><li> 기본 및 보조 항체 배양하고 다시 차 배양과 영상 사이에 떨고있는 동안 5 분 TBS-T로 막 3 회 반복한다. 주 : 대역 형광 또는 화학 발광 검출을 사용하여 검출 될 수있다. 검출을위한 제조 업체의 지침을 따르십시오. </li></ol></li><li> ELISA는 : 저장을 위해 냉동 샘플을 분석하기 전에 실온으로 평형을 유지해야합니다. 뜨는 condens을 통합 원심 분리기 샘플을 스핀 다운ATION. IL-1β의 측정을 위해 제조 업체의 지침을 따르십시오. 참고 :이 프로토콜에서 IL-1β는 특히 측정; 그러나, TNFα, IL-6, 및 면역 조절 사이토 카인 IL-10의 동시 측정은 적절한 조건은 프라이머 확인 하였다. </li></ol>

저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

염증성 사이토 카인은 바이러스 감염을 싸울 타고난 및 적응 면역 반응을 스티어링에 통합되어 있습니다. 분비되는 IL-1β는 인플루엔자 감염 3, 43, 44시 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 사이토 카인이 인간의 수지상 세포에 바이러스 성 인식에 대한 응답으로 처리됩니다되는 정확한 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 골수성 DC 아이솔레이션 키트는 비용과 시간이 걸린다. 격리 키?...

타고난 면역 시스템의 활성화는 감염, 질병, 예방 접종 7시 적응 면역 반응을 조종하는 데 필요합니다. 수지상 세포는 선천성 면역 체계의 세포를 제시하는 가장 강력한 항원이다; 그들은 항원의 흡수, 림프절 마이그레이션, 순진 CD4 +와 CD8 + T 세포 용해 세포 8-10의 활성화를 위해 전문화되어 있습니다. 빠른 병원체 검출을 사용하려면 타고난 면역 시스템은 보존 병원체 파생 모티브 또는 세포 스트레스와 손상의 호스트 파생 마커를 인식하는 수많은 생식 인코딩 패턴 인식 수용체 (PRR)를 사용합니다. 수용체 (TLR에) 같은 전화는 특정 세포 phagocytized 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPS) 및 위험 관련 분자 패턴 (감쇠)를 인식 막 결합 패턴 인식 수용체이다. 수용체 (NLRs) 같은 대비 고개를 끄덕으로 세포질하고 PAMPS 및 감쇠의 다양한 범위에 응답합니다. 수용체가 다시 같이 고개를 끄덕세포 표면 및 세포 내 이입 PRRS을 회피 병원균에 대한 방어의 두 번째 라인을 제시한다. 파생 병원균, 또는 &quot;위험&quot;의 상호 작용, 관련 TLR과 NLR 리간드 요소는 다른 면역 세포와 T 세포와 자연 살해 세포 활성화 (11)의 승진 증가 DC의 상호 작용의 결과로 DC의 성숙의 상태에 이르게한다. 인터루킨-1β는 감염에 대한 숙주 방어의 중요한 구성 요소입니다. 미생물의 인식 시점이 높은 염증성 사이토 카인 IL-1β가 분비되고 화학 유인과 타고난 및 적응 면역 세포의 활성화 등의 기능은. 생체 내 IL-1β는 발열과 염증성 사이토 카인 등의 급성기 응답을 크게 책임이있다 합성 12. 대부분의 NLRs 리간드 감지, 물질 œ 인 중앙 염기 결합 도메인 (NACHT)에서 작동하는 것으로 생각되는 C 터미널 류신이 풍부한 반복 도메인을 포함NLRP3의 올리고머, 단백질 단백질 상호 작용을 통해 다운 스트림 대상에 신호 전달을 매개 N 터미널 이펙터 도메인 (NLRP3의 PYD)에 대한 rtant. NLRP3 단백질은 가장 강렬하게 공부 inflammasome을 단지를 정의합니다. 이 단백질은 NLR 가족의 일원이고 NLRP3 (또한 ASC라고도 함) 어댑터 단백질 PYCARD 및 ICE 이루어지는 멀티 분자량 단백질 복합체를 형성하는 기능을 갖는다. inflammasome을 활성화시 PYCARD은 NLRP3 N 단말기 도메인에 바인딩하고 카스파 제 활성화 및 채용 도메인 (CARD) 도메인을 통해 ICE를 모집합니다. 인터루킨-1 전환 효소는 처음의 N-말단에 카드 모티브를 포함하는 효소 원으로 생성됩니다. 두 ICE의 분자를 데려 inflammasome을 형성 결과는 충분히 닫고 촉매 활성화를 유도한다. inflammasome을 단지는 사이토 카인 성숙 세포질 프로 IL-1β를 변환 할 수 있도록하여 ICE 활성화가 필요합니다. IL 성공적으로 분비-1β의 DC에있는 두 개의 서로 다른 독립적 인 위험 신호를 감지해야합니다. 첫째, PAMPS, 감쇠, 또는 사이토 카인 신호 (TNFα 나 IL-1β)의 TLR 감지 세포질 프로 IL-1β 단백질 발현의 상향 조절됩니다. 두 번째, 종종 다른 신호는 ICE의 성숙의 상류 inflammasome을 복합체 형성이 필요합니다. 신호를 자극하는 몇 inflammasome을 세균 막 기공 (예 nigericin)를 형성하는 독소 (예 : 글루타민산 소다 요 산염 결정, MSU 등) 리소좀 중단 결정하고, 세포 외 ATP (가) 있습니다. 이러한 다양한 활성제에 의해 inflammasome을 활성화 NLRP3로 이어지는 상류 메커니즘은 명확하지 않다. inflammasome을 형성 시그널링 상류 조사 연구는 저칼륨 유도 또는 반응성 산소 종 (ROS)와 같은 세포 내 사건 간접적 inflammasome을 13-28을 활성화하는 것이 제안되어있다. NLRP3의 inflammasome을 서로 다른 바이러스 성 활성제의 사이에 B를 제공 인플루엔자이며,IL-1β 분비 3, 29-33에 필요한 기본 및 보조 신호 OTH. 마우스 NLRP3 녹아웃 모델을 사용하여이 DC에있는 IL-1β의 분비가 32 NLRP3 의존하는 것으로 나타났습니다. 또한, NLRP3 녹아웃 마우스는 감염의 사이트에 적은 백혈구을 받고 높은 사망률 2, 5를 경험했다. 최근 두 논문은 인플루엔자 바이러스 감염시 NLRP3의 inflammasome을 활성화하기위한 메커니즘을 제안; 첫 번째, 두 번째 신호 다음에 세포질 프로 IL-1β 발현을 유도하는 TLR7 또는 TLR8 (응답 세포의 TLR의 발현에 따라 다름)에 의해 또는 다른 TLR에 의한 공생 박테리아의 검출을 통해 바이러스 성 RNA, NLRP3의 활성화의 인식을 통해 프라이밍 트랜스 골지 네트워크 (33, 34)에 바이러스 성 이온 채널 단백질 (M2)로 inflammasome을 형성. 후자의 공정에서, NLRP3의 inflammasome을 트리거링은 세포 내 이온의 외란에 의해 달성된다 &lt;EM&gt; inflammasome을 형성하는 신호로서 NLPR3 의해 감지 단순히이다 ROS 생산으로 이어지는 환경. 그러나, 인플루엔자 감염시 ICE 활동의 inflammasome을 활성화 상류의 정확한 메커니즘은 아직 불분명하게 남아있다. 이 작품은 잘으로 inflammasome을 활성화 한 다음 R848과 TLR8 결찰에 대한 응답을 기준으로 DC의 기초가되는 경로 IL-1β 분비의 추가 조사를위한 기초로 사용할 수 있습니다 인간의 moDCs에서 NLRP3의 inflammasome을 공부를위한 가치있는 기술을 설명합니다 NLRP3의 알려진 활성제, nigericin. 이 방법의 변형을 포함하는 다른 세포 유형과 함께 사용하지만, 이에 한정되지 수 : 단핵구, 대 식세포, 다른 DC 서브 세트 및 상피 세포.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

인터루킨의 분비 (IL)으로 인해 발생하는 염증성 과정 -1 면역 세포에 의해 가족의 사이토 카인이 로컬 또는 전신 염증, 조직 리모델링 및 수리, 및 바이러스 학적 제어 1, 2로 이어집니다. 인터루킨-1β는 타고난 면역 반응에 필수적인 요소이며 지속적인 감염 1-5의 설립을 방지하면서 병원균 침입 제거에 기여한다. Inflammasomes 1 전환 효소 (ICE 또는 카스파 1) 인터루킨의 활성화를위한 키 신호 플랫폼이다. NLRP3의 inflammasome을은 IL-1β 분비 6을 일으키는 DC가 적어도 두 개의 신호가 필요합니다. 프로 IL-1β 단백질 발현이 세포를 휴식에 제한된다; 따라서 프라이밍 신호는 IL-1β의 전사 및 단백질 발현에 필요합니다. 다중 단백질 NLRP3 inflammasome을 이용​​의 형성 NLRP3 결과에 의해 감지 제 2 신호. IR 업무 수지상 세포의 기능IL-1β 분비에 필요한 신호 D는 박테리아 독소와 NLRP3의 inflammasome을 활성화 한 다음 주요 세포 돌기 세포 (moDCs)을 파생 사람의 단핵구에서 TLR8에 의해 감지되는 합성 퓨린, R848을 사용하여 테스트 할 수 있습니다 칼륨 이온 운반체, nigericin. 단핵구 유래 수지상 쉽게 문화의 생산과 정제 된 인간의 골수의 수지상보다 훨씬 더 많은 세포를 제공한다. 그 대신 파생 마우스, DC가, 따라서 인간의 질병과 감염에 inflammasome을의 연구를 허용 체외 인간에 사용하는 여기에 제시된 방법은 다른 inflammasome을 분석 실험 다릅니다.

이 기술은 R848 프라이머를 TLR8을 측정합니다. 의 CD11c + moDCs - 프로 IL-1β에 대한 세포 내 사이토 카인 염색법은 CD14에서 현미경 및 외과 판독 할 수 있습니다. 두 기술은 프라이머 비, 또는 휴식, 휴대폰 제어뿐만 아니라 이소 제어 (도 1 및 2)에 상대적으로 정량화 될 수있다. 프로 IL-1β + 염색 세포의 비율은 평균 형광 강도 (MFI)를 제공하기 위해이 인구의 기하 평?...

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Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

수지상 세포 (DC가) nigericin와 NLRP3의 inflammasome을 활성화 한 다음 합성 퓨린, R848의 TLR8 인식에 응답하여 IL-1β 분비, 따라서 IL-1β는 NLRP3의 inflammasome을 활동을 측정하는데 사용될 수있다. 세포 내 사이토 카인 염색법, 면역 블롯 및 ELISA 정확하게 IL-1β의 발현을 통해 NLRP3의 프라이밍 inflammasome을 및 활성화를 측정하는 데 사용됩니다.

활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

activation-measurement-nlrp3-inflammasome-activity-using-il-1-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

20.7K 조회수.  New York University School of Medicine.  수지상 세포 (DC가) nigericin와 NLRP3의 inflammasome을 활성화 한 다음 합성 퓨린, R848의 TLR8 인식에 응답하여 IL-1β 분비, 따라서 IL-1β는 NLRP3의 inflammasome을 활동을 측정하는데 사용될 수있다. 세포 내 사이토 카인 염색법, 면역 블롯 및 ELISA 정확하게 IL-1β의 발현을 통해 NLRP3의 프라이밍 inflammasome을 및 활성화를 측정하는 데 사용됩니다. 

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Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin which forms an insoluble clot that stops hemorrhage. Factor V (FV) in its activated form, FVa, is a critical cofactor for the protease FXa and accelerator of thrombin generation during fibrin clot formation as part of prothrombinase 1, 2. Manual FV assays have been described 3, 4, but they are time consuming and subjective. Automated FV assays have been reported 5-7, but the analyzer and reagents are expensive and generally provide only the clot time, not the rate and extent of fibrin formation. The microplate platform is preferred for measuring enzyme-catalyzed events because of convenience, time, cost, small volume, continuous monitoring, and high-throughput 8, 9. Microplate assays have been reported for clot lysis 10, platelet aggregation 11, and coagulation Factors 12, but not for FV activity in human plasma. The goal of the method was to develop a microplate assay that measures FV activity during fibrin formation in human plasma.
This novel microplate method outlines a simple, inexpensive, and rapid assay of FV activity in human plasma. The assay utilizes a kinetic microplate reader to monitor the absorbance change at 405nm during fibrin formation in human plasma (Figure 1) 13. The assay accurately measures the time, initial rate, and extent of fibrin clot formation. It requires only &mu;l quantities of plasma, is complete in 6 min, has high-throughput, is sensitive to 24-80pM FV, and measures the amount of unintentionally activated (1-stage activity) and thrombin-activated FV (2-stage activity) to obtain a complete assessment of its total functional activity (2-stage activity - 1-stage activity).
Disseminated intravascular coagulation (DIC) is an acquired coagulopathy that most often develops from pre-existing infections 14. DIC is associated with a poor prognosis and increases mortality above the pre-existing pathology 15. The assay was used to show that in 9 patients with DIC, the FV 1-stage, 2-stage, and total activities were decreased, on average, by 54%, 44%, and 42%, respectively, compared with normal pooled human reference plasma (NHP).
The FV microplate assay is easily adaptable to measure the activity of any coagulation factor. This assay will increase our understanding of FV biochemistry through a more accurate and complete measurement of its activity in research and clinical settings. This information will positively impact healthcare environments through earlier diagnosis and development of more effective treatments for coagulation disorders, such as DIC.

This study describes a novel microplate assay that measures FV coagulation activity during fibrin clot formation in human plasma which has not been reported previously. The method uses a kinetic microplate reader to continuously measure the change in absorbance at 405nm during fibrin clot formation in human plasma.

Microplate 응고 분석을 사용하여 인간의 플라즈마에 반영 V 활동의 측정

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

연구

면역학 및 감염병학

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

생체 내에서 단핵구 화학 적 활동의 정량화 및 혈액 단핵구 유래 대식세포의 특성화

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

siRNA 전기 포진 포진 심플렉스 바이러스 유형 1-감염 단핵구 파생 수지상 세포에서 자가 포식을 조절

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

분화 한 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출의 시험관 내 자극 및 시각화

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and play a unique role within the immune system by linking the innate and adaptive immune responses. These cells can phagocytize and then present captured antigens to effector immune cells, triggering a diverse range of immune responses. This paper demonstrates a standardized method for the in vitro generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) isolated from cattle peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their application in evaluating vaccine immunogenicity.
Magnetic-based cell sorting was used to isolate CD14+ monocytes from PBMCs, and the supplementation of complete culture medium with interleukin (IL)-4 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) was used to induce the differentiation of CD14+ monocytes into naive MoDCs. The generation of immature MoDCs was confirmed by detecting the expression of major histocompatibility complex II (MHC II), CD86, and CD40 cell surface markers. A commercially available rabies vaccine was used to pulse the immature MoDCs, which were subsequently co-cultured with naive lymphocytes.
The flow cytometry analysis of the antigen-pulsed MoDCs and lymphocyte co-culture revealed the stimulation of T lymphocyte proliferation through the expression of Ki-67, CD25, CD4, and CD8 markers. The analysis of the mRNA expression of IFN-&#947; and Ki-67, using quantitative PCR, showed that the MoDCs could induce the antigen-specific priming of lymphocytes in this in vitro co-culture system. Furthermore, IFN-&#947; secretion assessed using ELISA showed a significantly higher titer (**p &#60; 0.01) in the rabies vaccine-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture than in the non-antigen-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture. These results show the validity of this in vitro MoDC assay to measure vaccine immunogenicity, meaning this assay can be used to identify potential vaccine candidates for cattle before proceeding with in vivo trials, as well as in vaccine immunogenicity assessments of commercial vaccines.

The methodology describes the generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) and their application for the in vitro evaluation of antigenic candidates during the development of potential veterinary vaccines in cattle.

소 단핵구 유래 수지상 세포를 이용한 백신 면역원성 측정

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...