본 연구는 결핵균과 인간 마이크로세포를 발현하는 미생물 센서 사이의 생화학적 상호작용을 연구하는 데 유용한 가이드를 제공하며, 결핵균이 섬유세포로 진입하는 데 중요한 역할을 하는 더 단단한 분자와 관련이 있을 것입니다. 수용체 상호 작용은 일반적으로 리포터 머신, 밀폐 분자, 레벨링 된 재조합 단백질, 녹아웃, 넉다운, 낮은 발현 모델의 사용을 사용하는 접근 방식을 사용하여 수년에 걸쳐 연구되었습니다. 이러한 기술은 까다롭고 시간이 많이 걸리며 때로는 비용이 많이 들 수 있습니다.
발표된 프로토콜을 사용하여 대식세포에서 SLMF1 수용체가 결핵균과 상호 작용하여 박테리아 흡수를 촉진하고 내분해체 성숙을 유도한다는 것을 처음으로 보여주었습니다. 유전자 발현 실험과 관련된 어려움을 극복하고 새로운 치료 전략에 대한 새로운 표적을 설명했습니다. 당사의 프로토콜은 유세포 분석 및 SLMF1 미생물 현미경을 사용하여 결핵 미생물과 SLMF1 미생물 센서 간의 생화학적 상호 작용을 검출하기 위한 두 가지 대안을 제공하며, 이 두 가지 기술은 일반적으로 사용 가능하고 유익하게 사용됩니다.
이 방법론은 많은 잠재적 용도가 있으며 다른 연구 맥락에서 쉽게 적용할 수 있습니다. 당사는 BSL2 조건에서 수행할 수 있지만 다른 수용체 및 살아있는 균주에 쉽게 적응할 수 있는 전체 세포 불활성화 및 초음파 처리 박테리아를 사용하여 결핵균 수용체 상호 작용을 평가하는 간단한 프로토콜을 제공합니다. 필요한 경우 이러한 분석은 다른 살아있는 병원체를 가진 BSL3 조건에서도 수행할 수 있습니다.
먼저 건강한 헌혈자로부터 채취한 혈액을 50ml 튜브에 조심스럽게 옮기고 식염수로 부피를 절반으로 희석합니다. 밀도 구배 배지를 준비하고 샘플을 원심분리하여 말초 혈액 단핵 세포, PBMC를 분리합니다.희끄무레한 헤일로에서 PBMC를 수집합니다.
세포 계수 챔버에서 세포를 계수한 후 CD14 비드로 자기 선택을 수행하여 CD14 양성 단핵구를 수집합니다. 그런 다음 분리된 세포를 RPMI 1640 배지에 재현탁시킵니다. 500마이크로리터의 CD14 양성 단핵구를 1배의 10배의 농도로 24웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 24웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 파종하여 순응도를 촉진합니다.
2시간 후 예열된 RPMI 1640 배지로 웰을 세척하여 비부착 세포를 제거합니다. 16-18시간 동안 1ml의 완전한 RPMI 1640 배지를 사용하여 단핵구를 대식세포로 구별합니다. 다음 날, 1ml의 PBS로 웰을 세척하고 각 웰에 1ml의 완전한 RPMI 1640 매체를 추가합니다.
10마이크로리터의 초음파 처리된 결핵균 항원으로 24시간 동안 대식세포를 자극합니다. 다음 날, P-1000 피펫을 사용하여 플레이트의 웰에서 전체 RPMI 매체를 폐기합니다. 차가운 PBS와 피펫을 위아래로 추가하여 대식세포를 수확합니다.
세포를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 500G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 보충된 방사성 면역침전 분석 완충액에 재현탁합니다.
10분마다 소용돌이치며 얼음 위에서 1시간 동안 현탁액을 배양합니다. 14, 15 분 동안 000G에 현탁액을 분리기를 설치하고 상층액을 모으십시오. 1 곱하기 10 6 전체 불활성화 mycobacterium tuberculosis 세포의 힘에 6 개의 불활성화 mycobacterium tuberculosis 세포를 1 곱하기 10 10 1 곱하기 10 하룻밤 동안 4 섭씨 온도에서 하룻밤 동안 6 개의 대식 세포의 힘으로 배양하십시오.
다음날, 단백질 박테리아 복합체를 염색하기 위해 항인간 SLAMF1 항체를 마이크로 튜브에 넣고 혼합물을 와류로 처리한 다음 어둠 속에서 섭씨 4도에서 30분 동안 밤새 배양합니다. 단백질 박테리아 복합체를 FACS로 세척한 후 FACS 완충액에 재현탁하고 유세포 분석기에서 샘플을 획득합니다. 둥근 노즈 수술용 핀셋을 사용하여 12mm 원형 덮개 슬립을 24웰 배양 플레이트의 웰에 넣습니다.
커버 슬립을 Mycobacterium tuberculosis rhodamine 항원으로 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 PBS 300마이크로리터에 희석한 단백질 추출물 100마이크로리터를 넣고 교반과 함께 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 플레이트의 뚜껑을 파라핀 필름으로 감쌉니다.
이전에 적정된 항 SLAMF1 1차 항체를 60마이크로리터 방울 떨어뜨려 파라핀 필름으로 덮인 뚜껑에 추가합니다. 구부러진 가는 팁 수술용 핀셋과 바늘을 사용하여 플레이트에서 커버 슬립을 조심스럽게 제거합니다. 1차 및 2차 항체 용액으로 배양한 후 과도한 액체를 제거하고 유리 슬라이드에 놓인 장착 액체 한 방울에 커버 슬립을 장착합니다.
슬라이드를 형광 현미경 아래에 놓고 적절한 필터를 사용하여 세포를 관찰합니다. 단핵구는 순도 95% 이상으로 PBMC에서 성공적으로 분리되었으며, 단핵구 유래 대식세포는 순응 및 야간 배양 후 생성되었습니다. 결핵균 항원으로 자극된 대식세포에서 SLAMF1 표면 발현을 유도하고, 유세포분석을 이용하여 그 수준을 확인하였다.
SLAMF1과 결핵균 전체 세포 간의 상호 작용은 가교 분석 후 유세포 분석을 사용하여 입증되었습니다. SLAMF1과 Mycobacterium tuberculosis 항원 간의 상호 작용은 병합된 이미지로 확인된 공동 국소화와 함께 형광 현미경을 사용하여 시각화되었습니다.
