Novel Stamp Device를 사용한 2차원 세포 배양에서 3차원 스페로이드/오가노이드 생성

우리의 연구 범위는 아가로스 주형에서 혁신적인 스텝 기반 마이크로웰 시스템을 사용하여 3차원 세포 배양 생성을 위한 효율적이고 재현 가능한 프로토콜을 확립하는 것입니다. 우리는 약물 검사, 유전자 공학 및 관련 응용 분야를 위한 균일한 고품질 3D 배양을 촉진하는 단순화되고 통제된 환경을 만드는 방법에 대한 답을 찾는 것을 목표로 합니다. 최근 3D 세포 배양 시스템의 발전으로 세포 상호 작용이 개선되고 생체 내와 유사한 환경이 더 많이 조성됩니다.

이 접근 방식은 스페로이드 오가노이드 형성을 향상시켜 생물 의학 연구를 위한 유망한 도구가 됩니다. 3D 세포 배양을 위한 현재 기술에는 행잉 드롭, 회전 세포 배양, 부착성이 낮은 플라스틱, 원뿔형 웰이 있는 플레이트, 미세 다공성 스캐폴드, 마그네틱 비드 및 스캐폴드가 없는 하이드로겔이 포함됩니다. 이러한 방법을 사용하면 각각 고유한 장점과 한계가 있는 3D 세포 구조를 형성할 수 있습니다.

당사의 프로토콜은 대규모로 일관된 크기와 품질로 균일한 3D 스페로이드 및 오가노이드를 생성하는 문제를 해결합니다. 생존력 및 세포 밀도 문제를 해결하고, 공정 중 처리 어려움 및 불안정성 문제를 해결하며, 신뢰할 수 있는 3D 세포 배양 연구를 위한 비용 효율적이고 재현 가능한 솔루션을 입증합니다. 당사는 환자 치료 전 약물 스크리닝 플랫폼으로서 제1형 당뇨병의 복귀 및 삼중 음성 인간 유방암 세포에서 스페로이드 오가노이드 생성을 목표로 연구 도구, 인슐린 생산 베타 세포의 오가노이드 생성 및 생체 고분자 캡슐화를 위한 스페로이드 생성을 추구하기 위해 최선을 다하고 있습니다.

지정된 소프트웨어를 사용하여 스탬프 장치를 설계합니다. 맞춤형 스탬프를 부드러운 강모 스펀지와 증류수로 씻어 잔여물을 제거합니다. 청결 스탬프를 5-10분 동안 자외선에 노출시켜 무균 상태를 보장합니다.

1-2 % 아가로스 용액을 준비하려면 필요한 양의 순수 아가로스 분말의 무게를 달아 PBS에 용해시킵니다. 아가로스가 완전히 녹을 때까지 용액을 전자레인지에 가열합니다. 다음으로, 약 3 밀리리터의 섭씨 40도 아가로스 용액을 6 웰 플레이트의 각 웰에 피펫으로 넣는다.

우물 중앙에 스탬프를 놓고 아가로스가 5-10분 동안 굳어지도록 합니다. 응고 후 stamp를 부드러운 앞뒤로 움직여 마이크로웰을 손상시키지 않고 진공을 해제합니다. 잔류물을 제거하기 위해 PBS로 마이크로웰을 세 번 세척합니다.

플레이트를 자외선에 10분 동안 노출시켜 미생물 오염을 제거합니다. 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 3ml의 배양 배지를 추가하고 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도의 플레이트를 밤새 배양합니다. 돼지 췌장도의 균일한 현탁액을 얻으려면 2차원 세포 배양에 트립신을 추가하여 세포를 해리합니다.

그런 다음 세포를 계수하고 농도를 조정하여 6웰 플레이트의 마이크로웰당 원하는 세포 수를 달성합니다. 3ml의 세포 현탁액을 아가로스 마이크로웰 위에 피펫팅하고 플레이트를 소용돌이쳐 균일한 분포를 보장합니다. 세포가 10분에서 15분 동안 중력에 의해 정착하도록 합니다.

그런 다음 현미경으로 침전된 세포를 관찰합니다. 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 2-3일에 한 번씩 기존 배지 또는 사용한 배지의 50%를 새 배지로 교체하십시오.

조밀한 3차원 구조가 완전히 형성될 때까지 배양을 계속합니다. 스페로이드 또는 오가노이드를 수집하려면 배양 배지를 제거하고 절단된 피펫 팁을 사용하여 격렬한 피펫팅을 통해 3차원 구조를 수집합니다. 조밀한 3차원 구조는 시간 의존적 세포 응집을 통해 관찰된 바와 같이 아가로스 마이크로웰에서 48시간의 배양에 의해 성공적으로 형성되었습니다.

아가로스 마이크로웰에서 제거 시 생존 가능한 3차원 구조가 유지되었으며, 구조 내에 살아 있는 세포를 나타내는 녹색 염색이 있어 세포 생존력과 안정성을 확인했습니다.