우리의 프로토콜을 사용하여, 액체와 같은 바이오 잉크 희석제의 다층은 캡슐화된 세포의 균일한 분산을 촉진할 뿐만 아니라 세포에 적합한 바이오잉크 환경을 유지합니다. 우리는 배출 인쇄 중에 세포에 높은 전단 응력 부하를 피하고, 바이오 잉크 저장소 내에서 캡슐화된 세포의 침전을 막기 위해 얼굴 간 장력을 사용합니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 균일 한 세포 분포와 3D 조직 구조를 생성 할 수 있습니다, 약물 스크리닝 및 재생 의학 연구에 사용하기위한 기능적 시험관 조직 금형을 제공.
바이오 잉크를 준비할 때, 이러한 요인이 잉크의 품질에 영향을 줄 수 있으므로 실험 온도 및 히그로겔 적재 절차에주의를 기울이는 것이 중요합니다. 준비를 시작하기 전에 0.22 마이크로미터 주사기 필터 장치를 사용하여 모든 재료를 살균하고 생물학적 안전 캐비닛에서 50도-섭씨 PBS에서 10% 최종 농도로 젤라틴을 용해하십시오. 50°C에서 적어도 1시간 동안 느린 교반을 하는 0.6 대 1 중량 비로 젤라틴 용액에 메타크릴 무수화물을 추가합니다.
인큐베이션이 끝나면 혼합 용액을 멸균 50밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 용액을 층으로 분리한다. 상부 GelMA 층을 수집하고 수집된 용액을 섭씨 40~50도의 2부로 희석합니다. GelMA 용액을 12~14킬로달톤 의 분자량 차단 투석 막으로 40~50도에서 5~7일 동안 분해된 물에 대해 투석을 하여 매일 두 번 물을 교체합니다.
투석이 끝나면 GelMA 용액을 하룻밤 동안 영하 80도에서 동결하십시오. 다음으로 3~5일 동안 냉동 건조기에서 영하 45도, 압력 0.2밀리바의 용액을 lyophilize합니다. 그런 다음 PBS에서 10%의 태아 소 혈청, 25 밀리몰러 HEPES 및 0.5%의 광신화로 보충된 효용젤마를 용해시합니다.
실크 섬유진 GelMA 바이오 잉크를 얻으려면 GelMA 용액을 초기 실크 섬유용액의 상이한 볼륨과 표에 제안된 PBS의 다른 부피와 혼합하십시오. 모든 바이오잉크가 준비되면 10~20분 동안 용액을 초음파처리합니다. 잉크가 초음파 처리되는 동안, 바이오잉크 용액당 15밀리리터 원뿔튜브로 80%의 컨실릭 NIH/3T3 세포 배양에서 세포를 수집하고 원심분리에 의해 세포를 펠릿한다.
그런 다음 수퍼나티를 조심스럽게 흡인시키고 바이오잉크 용액 농도의 밀리리터 당 6개의 세포로 10회 10시에 바이오잉크 2밀리리터로 각 튜브의 세포를 재연한다. 인쇄용 바이오잉크를 적재하려면 2밀리리터 주사기의 하단 층에 셀이 함유된 실크 섬유증 0.5 GelMA의 흡인 400 마이크로리터를 추가합니다. 주사기를 0-섭씨 0-섭씨 얼음 수조에 넣고 실크 섬유진 0.5 GelMA층에 셀 라덴 실크 섬유진 0.75 GelMA 바이오잉크 의 400 마이크로리터를 적재하기 전에 바닥 층 바이오크를 젤 상태로 변환합니다.
그런 다음 주사기를 얼음 욕조에 5분 동안 돌려보내, 셀라덴 바이오잉크의 각 추가 농도를 주사사기에 같은 방식으로 추가로 첨가합니다. 상이한 층 내에서 실크 섬유신의 농도가 다른 다층 바이오잉크 시스템이 달성되면, 30분 동안 37도-섭씨 인큐베이터로 바이오잉크를 재가열한다. 인큐베이션이 끝나면 27게이지 프린팅 노즐을 주사기에 적재하고, 분당 50마이크로리터로 유동 속도를 설정하고, 노즐의 이동 속도는 초당 2밀리리터로, 노즐의 높이를 1밀리미터로 설정합니다.
다음으로 실온에서 맞춤형 바이오프린터를 사용하여 조직 구조를 압출 방식으로 인쇄하고, 생체 인쇄 조직 구조를 800 밀리와트에서 40초 동안 365나노미터의 자외선과 교차 연결한다. 그런 다음 DMEM에서 교차 연결된 조직 구조를 배양하여 세포 배양 인큐베이터에서 10%의 태아 소 혈청과 1%페니실린 연쇄절제술을 보충하여 처음 2일 동안 8시간마다 배지를 변경하고 그 후 2~3일마다 배지를 변경한다. 이 대표적인 분석에서, 바이오프린팅 절차가 진행됨에 따라, 표적 우물내의 세포의 밀도는 모든 그룹에서 감소하였다.
실크 섬유통 제로 GelMA 그룹에서, 세포의 약 70%가 바닥 층으로 증착되었다. 실크 섬유증 1GelMA 그룹에서, 세포의 약 40%가 바닥 층으로 증착되었고, 세포의 약 5%가 상부 층에 증착되었다. 실크 섬유증 다층 GelMA 그룹에서 캡슐화된 세포의 증착은 대조군의 증착보다 더 균일했다.
이 프로토콜의 가장 중요한 부분은 SF-GelMA 바이오잉크 다층의 로딩입니다. 이 프로토콜은 액체와 같은 바이오 잉크를 사용하는 다른 압출 바이오 프린팅 분석에 적용될 수 있습니다.
