이 프로토콜은 사용자가 이전 연구에서 수집및 보관된 냉동 조직에서 미토콘드리아 샘플을 준비할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 프로토콜은 또한 조직 수확을 위한 살아있는 동물의 사용을 감소시킵니다. 이 기술을 사용하면 사용자가 이전에 냉동 된 아카이브 조직을 사용하여 미토콘드리아 농축 샘플을 부드러운 조직 파쇄 방법을 사용하여 제조 할 수 있습니다.
이 준비 방법은 미토콘드리아 제제의 수율을 극대화합니다. 프로토콜을 읽으면 모든 구성 요소 와 도구의 가용성을 보장하고 완전히 충전 된 파쇄기 드라이브를 확인하고 단계에 익숙해지기 위해 원치 않는 조직과 함께 운동하는 것이 좋습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 연구 동료 인 Edina Kosa가 될 것입니다.
우선, 심장 조직을 포함하는 튜브의 무게를 기록합니다. 이제 빈 튜브의 무게를 측정하고 심장 조직의 순 무게를 얻기 위해 이전에 기록 된 무게에서 빼냅니다. 얼어붙은 심장 조직을 얼음-차가운 용액의 비커에 직접 넣습니다.
5분간 저어줍니다. 동시에 핀셋을 사용하여 가능한 한 많은 혈액을 얻기 위해 조직에 약간의 압력을 가합니다. 집게로 조직을 꺼내 깨끗한 필터 종이 타월로 심장을 짜서 혈액을 제거하십시오.
그런 다음 조직을 얼음 차가운 용액의 또 다른 비커에 넣습니다. 5 분 동안 조직을 교반 한 후, 종이 타월에 조직을 부드럽게 말리고 지방, 응고 혈액, 오리클 및 근막을 제거합니다. 심실 조직을 풀.
조직 샘플을 분쇄하려면 50~300밀리그램의 심장 조직을 램 측의 조직 분쇄챔버에 넣고 램 쪽을 닫습니다. 그런 다음 튜브의 캡 측에 세척 버퍼의 약 0.2 ~ 0.8 밀리리터를 추가합니다. 튜브 도구를 사용하여 분쇄기 캡으로 분쇄기 챔버를 과도하게 조이지 않고 아늑하게 캡하십시오.
파쇄기 챔버를 분쇄자 홀더 유닛에 넣고 램 면을 아래로 내려 놓습니다. 분쇄기 캡으로 완전히 충전된 분쇄기 드라이버의 비트를 삽입하고 결합하여 비트가 제자리에 고정되도록 한 다음 분쇄기 홀더의 압력 표시등이 약 2개의 설정에 도달할 때까지 분쇄기 챔버의 분쇄기 드라이버에 압력을 가합니다. 트리거를 누르고 두 개의 설정을 유지하면서 파쇄기 드라이버를 약 10~12초 동안 실행합니다.
튜브를 관찰하여 리시스 디스크를 통해 조직 질량의 전부 또는 대부분을 상부 분쇄기 챔버로 파쇄하고 전달하고 필요한 경우 튜브를 분쇄자 홀더로 돌려 보내 파쇄를 계속합니다. 시료를 분쇄한 후 분쇄기 챔버를 홀더 유닛 밖으로 들어 올리고 튜브 도구를 사용하여 분쇄기 캡을 제거하고 나중에 다른 조직 샘플의 교차 오염을 피하기 위해 동일한 샘플 내에서만 사용하는 것이 좋습니다. 파쇄된 심장 조직을 40밀리리터의 세척 완충제로 세컨드 비커로 옮기고 교반판에 있는 동안 중간 속도로 5분간 조직을 저어줍니다.
미리 젖은 나일론 메쉬 모노필라멘트를 통해 서스펜션을 필터링합니다. 여과를 폐기한 후 파쇄된 조직을 10밀리리터의 세척 완충제로 필터에 세 번 세척합니다. 세척된 조직을 50밀리리터 비커로 옮기고, 20밀리리터의 세척 버퍼를 자기 교반에 넣습니다.
트립신 용액의 0.5 밀리리터를 추가하면서 15분 동안 지속적으로 저어줍니다. 교반을 통해 약 반쯤 티슈 서스펜션을 느슨하게 장착된 핸드헬드 유리 온 글래스 균질화제로 전달하여 15밀리리터의 부피를 보유할 수 있다. 거품을 생산하지 않고 4 ~ 5 개의 부드러운 스트로크로 서스펜션을 균질화하십시오.
그런 다음, 50 밀리리터 비커에 호모게네이트를 놓고 교반 접시에 섞습니다. 다음으로, 트립신 억제제가 함유된 절연 버퍼10밀리리터를 균질에 넣고 부드럽게 교반하면서 배양한다. 나일론 필터를 통해 서스펜션을 다시 걸러낸 후 필터를 50밀리리터 원추형 튜브에 저장하고 필터에 남은 미립자 분획을 유리 온 유리 균질화제로 옮긴다.
세척 버퍼의 15~20밀리리터에서 25~30초 동안 손으로 부드럽게 균질화합니다. 호모게네이트를 여과물과 결합하고 튜브의 균형을 맞추고 원심분리기를 사용한 다음 플라스틱 파이펫을 사용하여 상피 펠릿 의 상단에서 0.2 밀리리터를 남깁니다. 나일론 필터를 사용하여 결과 상체를 새로운 원뿔 튜브로 필터링하여 오염및 원심분리기를 한 번 더 피하십시오.
상체를 폐기한 후 펠릿을 파손하거나 오염시키는 것을 방지하기 위해 튜브 측면에 격리 버퍼를 추가하여 펠릿을 2~3회 세척한다. 매번 푹신한 흰색 외부 림 레이어를 폐기하십시오. 각 튜브에 절연 버퍼 5밀리리터를 추가하고 1 밀리리터 팁 또는 새로운 이송 파이펫이 있는 파이펫을 사용하여 펠릿을 분해한 다음 서스펜션을 추가 절연 버퍼 20밀리리터로 희석하고 섭씨 4도에서 15분 동안 서스펜션을 8, 500 X g에서 원심분리합니다.
상체를 폐기한 후 펠릿을 5밀리리터로 먼저 회수한 다음, 섭씨 4도에서 15분 동안 8, 500 X g에서 재차중단 버퍼와 원심분리기의 15밀리리터를 추가로 회수한다. 이제 상체를 버리고 씻은 그대로 미토콘드리아가 들어있는 갈색 펠릿을 저장합니다. 프로테아제 억제제를 포함한 재중단 완충제의 250 마이크로리터에서 미토콘드리아 농축 펠릿을 다시 중단한다.
Aliquot는 25 마이크로리터 부피의 현탁액을, 액체 질소의 빠른 동결 및 몇 년 동안 섭씨 80도 깊은 냉동고에 보관하십시오. 프로토콜에 따라 미토콘드리아농축 단백질은 두 그룹의 뿌리에 태어난 자손의 심장부에서 제조되었다. 하나는 임신 중에 운동을했고 다른 하나는 앉아있었습니다.
ETC 단백질 프로파일 분석은 운동 된 뿌리의 자손이 ETC 복합체 중 일부에서 상대적으로 감소 된 수준을 제시한다는 것을 밝혔다. 미토콘드리아 단백질은 3~8%의 그라데이션 BN-PAGE에서 해결되었으며 항체 칵테일로 면역 프로브를 하였다. 운동과 앉아있는 그룹 모두 여러 초복합체를 전시합니다.
관찰 된 눈에 띄는 슈퍼 컴플렉스 증가는 앉아있는 그룹에 비해 운동 그룹에서 9 개월이었다. 운동 분석기를 이용하여 복합 I-II 활성을 위해 48시간 3개월, 6개월 9개월의 다른 연령대로부터 얻은 미토콘드리아 농축 단백질을 분석하였다. 운동 그룹은 앉아있는 그룹의 것과 비교하여 복잡한 I-II 활동을 보여 주었다.
냉동 조직 및 세포에서 얻은 미토콘드리아에 대한 기능적 연구의 타당성은 다른 조사자들에 의해 나타난다. 냉동 조직으로부터 얻은 미토콘드리아의 제제는 최소한의 손상으로 다양한 조직에 적용될 수 있다.
