저자는 지원 유동 세포 계측법 제임스 Oesterling에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 미국 국립 암 연구소 (R01-CA178380, ZY)와 미국 국립 연구소 박사후 훈련 보조금 (5T32CA009035-37, LWY)에서 부여에 의해 지원되었다.

이 프로토콜에서 동물의 사용은 폭스 체이스 암 센터의 동물 관리 및 사용위원회의 승인 절차에 따라 수행되었습니다. 인스트루먼트, 솔루션 및 Coverslips는의 1 준비 <ol><li> # 5 미세 집게의 청소 두 세트, # 7 한 세트의 미세 곡선 포셉, 하나의 큰 수술 가위, 한 microdissecting 가위, 한 주걱 하나 천공 숟가락. 자체 밀봉 멸균 파우치 및 오토 클레이브에 악기를 배치합니다. 사용할 준비가 될 때까지 주머니에 상품을 보관하십시오. </li><li> 3 % 낮은 용융 온도 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 거품이 나타날 때까지 멸균 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS) 50 ㎖에 1.5 g 아가로 오스를 추가 한 다음 전자 레인지와 더위에 배치합니다. 모든 아가 때까지 소용돌이 플라스크 및 재가열은 해산했다. 수풀이 나타나면 이전 가열 교반 막대와 솔루션을 섞는다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 보관 솔루션까지 필요. </li><li> 장기 저장 상에 대한전자, 개월 동안 실온에서 4 ° C에서 향후 사용을 위해 아가로 오스 솔루션을 저장합니다. 액화 전자 레인지에 재가열. 아가로 오스 용액의 반복 가열 따뜻한 멸균 증류수 초기 중량을 유지하도록 가열하기 전에 플라스크의 무게. </li></ol></li><li> 이전에이 설명 된대로 파파인 기반의 세포 분리에 대한 다음과 같은 솔루션을 준비 : <ol><li> 멸균 페놀 레드를 DPBS에 함유 파파인 (100 U / ㎖), 시스테인 (0.2 ㎎ / ㎖) 및 DNase의 (250 U / ml)로 파파인 용액. </li><li> 소 혈청 알부민과 오보 뮤코 이드 용액 (BSA, 8 ㎎ / ㎖), 대두 트립신 억제제 (8 ㎎ / ㎖))과의 DNase (250 U / ㎖) 멸균 페놀 레드 - 함유 DPBS에서. 필터 솔루션을 모두 소독 및 페놀 레드 함유 DPBS의 원래 색상을 반환하는 산도를 조정합니다. </li></ol></li><li> 세포 배양액 (NB / B27)를 제조 : 1 mM 피루브산 나트륨, 2 mM의 L-글루타민을, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S) 및 B27 보충제와 기저 용지를 보충. FilteR 소독 및 빛으로부터 보호합니다. 사용하기 전에 37 ° C에서 미디어와 5 % CO 2를 평형. </li><li> FACS 버퍼를 준비 : 5 % 소 태아 혈청 DPBS에서 (FBS). 47.5 ML의 DPBS에 2.5 ML의 FBS를 추가합니다. </li><li> 폴리-D-라이신 (PDL) 코팅 된 커버 슬립을 준비합니다. <ol><li> 오토 클레이브 새로운 유리 커버 슬립. </li><li> 코트 PDL와 커버 슬립 (멸균 증류수 100 μg / ㎖) 및 37 ° C에서 2 시간 동안 배양 또는 실온에서 하룻밤. </li><li> 세척 멸균 증류수로 된 커버. NB / B27 매체와 한 번 씻으십시오. 커버 슬립은 사용하기 전에 조직 문화 후드 완전히 건조 시키십시오. </li></ol></li></ol> 조직 조각의 2 해부 및 준비 <ol><li> 해부의 날, 흡수 패드와 70 % 에탄올 및 커버 해부 영역을 닦아. </li><li> 멸균 파우치 해부 도구를 제거합니다. 얼음 차가운 얼음에 작은 페트리 접시와 장소에 멸균 DPBS / 1 % P / s의를 추가합니다. </li><li> 목을 벨 P4 MATH1-GF큰 수술 가위로 P / 네 스틴 - CFP 마우스 새끼는 잘 곡선 집게로 머리를 누르십시오. 피부를 제거하고 부드럽게 미세 겸자 후 주걱을 이용하여 두개골로부터 뇌를 꺼내서 DPBS / 1 % P / 초를 포함하는 페트리 접시로 전송 # 5와 두개골을 벗겨. <ol><li> # 5 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 뇌의 나머지 부분에서 소뇌를 구분합니다. 가능한 빨리 한 번에 하나의 강아지를 해부해야합니다. </li><li> 분자 및 기능적 분석을위한 충분한 네프를 얻기 위해 8 소뇌의 최소 수집. </li></ol></li><li> 3 % 낮은 용융 온도 아가로 오스 용액을 2 × 2 × 2cm를 측정 삽입 금형을 입력합니다. 아가로 오스의 온도가 더 이상 37 °의 C 없는지 확인하십시오. </li><li> 실험실 조직을 부드럽게 dabbing에 의해 소뇌 물기를 제거합니다. 수직으로 금형에 소뇌를 놓습니다. 신속 공고히 할 수 있도록 얼음에 금형을 놓습니다. 블록 당 ~ 4 소뇌를 사용합니다. </li><li> 리를 얻진동 블레이드와 vibratome ving 조직 섹션. 면도날과 소뇌 함유 아가로 오스 블록을 낸다. 수직으로 지향 소뇌와 vibratome 판 아가로 오스 블록을 붙인다. </li><li> 아래 얼음처럼 차가운 멸균 DPBS / 1 % P / S와 장소 얼음 vibratome의 트레이를 입력합니다. <ol><li> 소뇌의 전체 길이를 600 μm의 섹션을 잘라. 천공 숟가락을 사용하여 얼음 트레이에서 섹션을 수집합니다. 얼음에 DPBS / 1 % P / S 가득 페트리 접시에 넣어 섹션. </li></ol></li></ol> 3 이외에 Microdissection 및 세포 분열 <ol><li> 형광 해부 현미경 조직 슬라이스가 들어있는 페트리 접시를 놓습니다. <ol><li> 신중하게 (도 1에 점선 참조) CFP + 분자 층 및 GFP + EGL 사이에서 해부에 의해 미세 핀셋을 이용하여 소뇌 섹션의 나머지로부터 분리 EGL. 될 것이다, 분자 층의 일부를 포함하지 않도록주의하십시오네 스틴 발현 버그만 글리의 오염. </li><li> 가능한 한 빨리이 단계를 완료하고 세포 사멸을 방지하기 위해 얼음에 조직을 유지합니다. </li><li> 다음 단계로 진행하기 전에 주변 조직 아가로 오스를 제거한다. </li></ol></li><li> 이전에 단일 세포 현탁액을 수득 2 바와 같이 파파인 기반 프로토콜을 사용 microdissected EGL 조직 다이제스트. <ol><li> FACS를 통해 CFP 양성 세포의 수집을 위해 FACS 버퍼에 세포를 다시 일시 중지합니다. </li></ol></li></ol> 4 셀 정렬 및 도금 <ol><li> CFP 적절한 필터를 포함하고 얼음에 FACS 완충액에 세포를 수집 사이토 멸균, 고속의 흐름을 이용하여 CFP 형광 용 정렬 셀. 각 P4 소뇌에서 약 100,000 네프를 얻습니다. </li><li> 5 분 동안 300 XG에 원심 분리기 세포. 추가 실험을위한 분자 분석이나 문화에 대한 즉시 세포를 사용합니다. </li><li> 배양 세포에, 미리 예열 NB / B27의 m에서 세포를 다시 일시 중단PDL-코팅 된 커버에 edia 및 판은 이전에이 설명했다. </li></ol>

<ol>
	<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22, 103-114 (1999).</li><li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Riobo, N. A., Manning, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+signal+transduction+employed+by+vertebrate+Hedgehogs.">Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs.</a> Biochem J. 403, 369-379 (2007).</li><li>Dahmane, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sonic+Hedgehog-Gli+pathway+regulates+dorsal+brain+growth+and+tumorigenesis.">The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis.</a> Development. 128, 5201-5212 (2001).</li><li>Marino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma:+developmental+mechanisms+out+of+control.">Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control.</a> Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).</li><li>Yang, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells.">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li><li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants.">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Sutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+stem+cells+act+as+medulloblastoma-initiating+cells+in+a+mouse+model+and+a+neural+stem+cell+signature+characterizes+a+subset+of+human+medulloblastomas.">Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas.</a> Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).</li><li>Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells.">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

여기에 설명 된 미세 절제 방법은 분자와 기능적 분석에 사용하기 위해 살아있는 세포의 순수 모집단을 분리 할 제 절차이다. 리 등. 구에 의해 알 수 있듯이, 이 방법에 의해 얻어진 배양 네프 다양한 실험에 통합 때문에 고순도, 또한 마이크로 어레이 분석에 이용 될 수있다. 그것은이 미세 절제 기술에 능숙하게 시간이 걸리는 것이 매우 중요하다. 네...

소뇌 여러 세포층, 각각 별개 함유 세포 유형으로 구성된다. 분자 층 및 조롱박 층은 각각 버그만 글리와 조롱박 신경 세포를 포함하는 동안 개발 과정에서 EGL은 과립 신경 세포 전구체 (GNPs)를 증식 포함되어 있습니다. 소뇌 내 깊은 신경 줄기 세포 (NSCs의)와 희소 돌기 아교 세포 하나가 들어있는 흰색 물질을,있다. 소닉 헤지 호그 (쉬) 소뇌 발달을 조절하는데 중요한 역할을하고, 특히, 그것은 기워 수용체 PTC (), 쉬 2-4 시그널링 네거티브 레귤레이터에 결합을 통하여 GNPs의 증식을 촉진시킨다. 쉬 시그널링의 비정상적인 활성화가 모세포종 (MB), 5,6 어린이에서 가장 흔한 악성 뇌종양을 생성한다. PTC 돌연변이 MB 형질 전환 마우스 모델은 MB의 연구를위한 강력한 도구이며, 인간의 MB 7,8를 닮은 종양을 개발합니다. 사용이마우스, 그것은 GNPs 고슴도치 형 MB 7의 원래 세포 것을 발견되었다. 또한, GNPs 외에, 우리는 또한 최근에 MB를 야기 할 수있는 현상 소뇌 EGL 내의 신경 전구 세포의 집단을 고유 식별했습니다. 이러한 세포 유형 VI 중간 필라멘트 단백질, 네 스틴의 높은 수준의 발현 및 네프 9 불린다. 네프는 EGL의 깊은 부분에 위치한 유일한 신생아 소뇌 개발 과정에서 일시적으로 존재한다. 그들은 GNPs와 과립 세포 계보에 최선을 다하고 있지만,이 대기하고 MATH1, 기존의 GNPs 10 잘 설립 마커를 발현하지 않는 별개 있습니다. 또한, 네프 그들 MB의 종양에 대한 새로운 기원하게 쉬의 신호 전달 경로 (9)의 활성화 이후 MB에 상승보다 효율적으로보다 GNPs을 제공합니다. 우리는 이전에 미세 절제 기술에 의해 출생 후의 일 4 (P4)에서 소뇌 EGL에서 네프 격리여기에 9 설명했다. 조직의 직접 현미경 시각화를 통해 미세 절제는 소뇌 EGL의 특정 해부 수 있습니다. 네 스틴도 소뇌 백질과 분자 층 1,7,11,12에서 버그만 글리에 의해 NSCs을 표현하고 분석을 혼동 하듯이,이 세포를 포함하지 않는 것이 중요했다대로이 필요합니다. microdissected 조직에서 분리 한 세포는 분자 분석을 위해 즉시 이용 될 수도 있고 또 애플리케이션을 배양 할 수있다. 특히 EGL을 microdissecting을 돕기 위해 더욱 네프를 정화, MATH1-GFP (녹색 형광 단백질) 마우스는 네 스틴-CFP (시안 형광 단백질) 마우스와 함께 넘어졌다. 구체적 MATH1 GNPs 및 GFP 발현에 의해 표현되는 전사 인자는 EGL 9, 13에서 명확하게 볼 수있다. 네 스틴 - CFP 생쥐 CFP의 핵 형태를 표현하고 쉽게 9,14 분자 층으로 시각화 될 수있다. 함께, CFP 및 GFP 발현 EGL의 미세 절제를위한 경계를 생성 (도 1 참조). CFP 양성 네프는 다음 해부 EGLs의 효소 분해 다음, FACS에 의해 고립되었다. 현재 EGL에서 세포를 분리하기위한 가장 잘 이용 방법은 전체 소뇌 조직 (15, 16)의 퍼콜 구배 원심이다. 그러나,이 방법은 완전히 분자 층과 백질에서의 네 스틴 + 세포 집단을 배제 할 수 없으며, 따라서 네프의 연구에 사용될 수 없다. 관심의 세포를 제거하기 위해 레이저 에너지의 전달을 사용하여 레이저 캡처 미세 절제는 이종 조직 (17, 18)의 특정 세포를 분리하기 위해 사용되지만 캡처 세포에서만 DNA, RNA 및 단백질의 복구를 위해 사용될 수없는 수있는 또 다른 방법이다 수는 배양한다. 이 프로토콜은 특히 EGL에서 네프의 살아있는 순수한 인구를 분리하는 방법을 제공합니다.이 기술은 인식 할 수있는 해부학 적 구조 또는 형광 표지 세포 / 영역들 중 하나가 다른 조직 유형에 적용될 수있다. 따라서, 세포 격리 프로토콜에이 신규 한 미세 절제 기술을 통합의 주요한 장점은 세포 조직에 인접 오염을 제거하는 특정 조직 영역으로부터 분리 될 수 있고, 셀이 다른 애플리케이션에 대한 분석 또는 배양 즉시 수집 될 수 있다는 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="572">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Neurobasal media</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PDL</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">ultra pure low melting temperature agarose</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">DPBS</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection

미세 절제는 조직의 특정 지역을 격리하며 인접 지역에서 휴대 소스에서 오염을 제거 할 수있는 새로운 기술이다. 이 방법의 첫 번째 연구에서 이용 된 네 스틴을 발현하는 전구 세포 (네프)를, 소뇌 새싹 외부 층 (EGL) 세포의 새롭게 식별 인구. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)과 조합 미세 절제를 사용 네프의 순수한 인구 소뇌 EGL 종래 과립 뉴런 전구체로부터 다른 오염 네 스틴 발현 세포 별도로 수집 하였다. 미세 절제없이 네프의 기능성 분석은 퍼콜 구배 원심 분리 및 레이저 캡처 미세 절제으로 사용할 현재의 방법으로 불가능했을 것이다. 이 기술은 또한 인식 할 수있는 영역 또는 형광 표지 된 세포 중 하나를 포함하는 다양한 조직과 함께 사용하기 위해 적용될 수있다. 이 microdissectio 중 가장 중요한 것은, 가장 큰 장점N 기법은 절연 세포 사는 다른 한 방법으로 현재 불가능 추가적인 실험, 배양 될 수 있다는 것이다.

도 1a에 도시 된 바와 같이, 소뇌 슬라이스 된 소뇌 EGL는 GFP 발현 GNPs을 지배하고, 분자 층은 CFP 양성 신경 교세포에 의해 농축시키고, P4 MATH1-GFP / CFP 네 스틴 - 마우스로부터 제조 하였다. (; 그림 1A 점선을 따라) EGL의 깊은 부분에있는 네프를 분리하려면 슬라이스 EGL 및 분자 층 사이에 microdissected되었다. 해부 EGLs (그림 1B)는 다음 FACS 다음 효소 분?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection at JoVE.com

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

네 스틴 발현 전구 세포는 개발 소뇌의 신경 전구 세포의 새로 확인 된 집단이다. 형광 - 활성화 세포 분류와 조합하여 여기에 제시된 미세 절제 기술을 사용하여,이 세포 집단은 다른 소뇌 영역에서 오염없이 정제 될 수 있고, 추가 연구 동안 배양 될 수있다.

이외에 Microdissection에 의해 개발 소뇌 차별화 된 세포 집단의 분리

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

isolation-distinct-cell-populations-from-developing-cerebellum

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K 조회수.  Temple University Health System.  네 스틴 발현 전구 세포는 개발 소뇌의 신경 전구 세포의 새로 확인 된 집단이다. 형광 - 활성화 세포 분류와 조합하여 여기에 제시된 미세 절제 기술을 사용하여,이 세포 집단은 다른 소뇌 영역에서 오염없이 정제 될 수 있고, 추가 연구 동안 배양 될 수있다. 

비디오: Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

연구

신경과학

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

레이저 포획 미세 절에 의해 마우스 척수 모터 신경 세포 체에서 전사 분석을위한 RNA의 생산

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

영상 모니터 세포 생물학과 여러 신경 인구의 계보 진행을 추적 하는 단일 셀 다음 라이브

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or regions from heterogenous tissues. Captured product can be used in a variety of molecular methods for protein, DNA or RNA isolation. However, preservation of RNA from postmortem human brain tissue is especially challenging. Standard visualization techniques for LCM require histologic or immunohistochemical staining procedures that can further degrade RNA. Therefore, we designed a stainless protocol for visualization in LCM with the intended purpose of preserving RNA integrity in post-mortem human brain tissue. The Purkinje cell of the cerebellum is a good candidate for stainless visualization, due to its size and characteristic location. The cerebellar cortex has distinct layers that differ in cell density, making them a good archetype to identify under high magnification microscopy. Purkinje cells are large neurons situated between the granule cell layer, which is a densely cellular network of small neurons, and the molecular layer, which is sparse in cell bodies. Because of this architecture, the use of stainless visualization is feasible. Other organ or cell systems that mimic this phenotype would also be suitable. The stainless protocol is designed to fix fresh-frozen tissue with ethanol and remove lipids with xylene for improved morphological visualization under high magnification light microscopy. This protocol does not account for other fixation methods and is specifically designed for fresh-frozen tissue samples captured using an ultraviolet (UV)-LCM system. Here, we present a full protocol for sectioning and fixing fresh frozen post-mortem human cerebellar tissue and purification of RNA from Purkinje cells isolated by UV-LCM, while preserving RNA quality for subsequent RNA-sequencing. In our hands, this protocol produces exceptional levels of cellular visualization without the need for staining reagents and yields RNA with high RNA integrity numbers (&#8805;8) as needed for transcriptional profiling experiments.

This protocol uses a stain-free approach to visualize and isolate Purkinje cells in fresh-frozen tissue from human post-mortem cerebellum via laser capture microdissection. The purpose of this protocol is to generate sufficient amounts of high-quality RNA for RNA-sequencing.

레이저에서 고품질 RNA 격리 스테인리스 프로토콜 캡처 Microdissected Purkinje 세포 인간의 사후 소 뇌에

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...